饲料液态酶及其后喷涂工艺的研究与应用

饲料液态酶及其后喷涂工艺的研究与应用饲料安全是关系到食品安全和消费者利益的一件大事，是全社会关注的热点。实现畜产品“绿色化”的核心问题是精确使用抗生素等药物类添加剂，更多地应用诸如酶制剂、微生物制剂等“绿色”生物技术产品，以解决畜牧生产中疾病的预防、生产性能的提高等问题。饲用酶制剂作为一种新型“绿色”环保添加剂，自从1975年美国饲料工业首次把酶制剂作为添加剂应用于配合饲料中并取得显著效果后，饲用酶制剂日益受到世界养殖业的重视。其效能特点有：①补充动物内源酶的不足，提高饲料报酬；②降解植物细胞壁，促进营养物质的消化吸收；③消除饲料中的抗营养因子，提高饲料安全性；④增强动物的抗病能力，提高畜禽成活率；⑤降低氮、磷的排泄量，减少环境污染。⑥降低饲料成本。饲料酶按功能主要分为两类：一类是降解单底物的植酸酶、淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶等单酶，其中以植酸酶和木聚糖酶、甘露聚糖酶应用最普遍，多采用基因工程菌液体发酵生产。另一类是以非淀粉多糖为底物，真菌固体或液体发酵，进一步复配单酶加强的复合酶。为了提高饲料酶的使用效果，需要从酶学性质改进和使用方法优化两方面研究。酶学性质包括酶活、底物适应性、pH曲线、温度曲线、结构稳定性等酶蛋白本身特征，主要由生产菌种和生产工艺决定。使用方法包括酶的剂型、储存稳定性、加工稳定性、酶的配比和剂量与作用饲料底物的对应降解效果。康地恩生物集团等酶制剂生产商建设现代化生产基地，构建高效工程菌株，改进发酵工程技术，配合颗粒饲料大力推广先进的液态酶后喷涂工艺，成为2008年饲料酶一大亮点。一、基因工程菌株的构建人们为了解决单胃动物不能利用植物中植酸磷、非淀粉多糖的问题而寻找并发现了植酸酶、木聚糖酶、纤维素酶等饲料酶。对这种应用性很强的酶所进行的基因工程研究紧紧围绕着工业化应用这一中心目标。基因工程饲料酶在养殖业中的应用，有三种可能的途径。第一，通过植物基因工程改造饲料用作物，直接在植物的籽实中表达合适的植酸酶，省去了植酸酶的生产及其在饲料中的添加。Pen等(1993)首先在烟草种子中成功地表达了外源基因植酸酶，植酸酶的表达量达到种子中可溶蛋白的1%、叶片可溶性蛋白的14.4%[1]。LiJ于1997年在大豆(Glycinemax)的籽实中成功表达来自黑曲霉的植酸酶，并且其酶学性质与出发菌株所产的相同；饲喂实验结果表明同样可以提升家禽对植酸磷的利用率[2]。近年来，在水稻、苜蓿、玉米、油菜中成功表达植酸酶。但是由于植物籽实作为配合饲料的原料经过饲料生产的全过程，因此其中所包含的植酸酶必须经历高温制粒的过程。同时由于各地用作动物饲料的作物种类甚或品种往往不同，很难仅仅为了提高家畜家禽的植酸磷利用率而大规模弃用原来的优势品种。植酸是植物体内的第二信使之一，在植物生长发育过程中起着重要的作用，也是种子储存磷的主要机制，如果植酸酶过量表达，会对植物造成伤害，出芽率较低[3-6]。转基因植物可以表达具有活性的β-葡聚糖酶和木聚糖酶，并正常生长发育。作为结构物质的非淀粉多糖，如果非淀粉多糖相关酶的合成量提高，也会打破该植物整体的生理平衡，出现倒伏、减产[7]。第二，利用现代转基因动物技术，使饲料酶基因在单胃动物消化道内源表达，无须外部添加。SergueiP等于2001年将ECP编码基因appA转化入小鼠中。55kDa的活性植酸酶蛋白通过唾液腺分泌入唾液中。转植酸酶基因小鼠的粪便中磷的含量与阴性对照相比降低了11%。GolovanSP等于2001年将植酸酶基因转入猪内，分泌含有植酸酶的唾液以分解食物中的植酸磷，它排出的粪便中含磷量与对照相比降低了75%。这方面的研究起步较晚，仍有许多问题有待解决，其中最主要的是转基因过程对动物体的损伤，及如何避免等问题[3-5]。第三，微生物发酵生产饲料酶，作为固体饲料添加剂预混在粉状配合饲料中，或制备液体酶在高温制粒后喷涂于颗粒饲料表面。这种策略对使用者来说最为简单易行，但对植酸酶的生产者提出了很高的要求。在微生物体内，植酸酶并非持家基因，因此天然菌株生产植酸酶的能力十分低下，远远不能满足饲料成本控制的需要。野生型黑曲霉NRRL3135菌株产植酸酶的最高水平为6.8U/ml，采用现代基因工程技术大幅提高生产植酸酶的能力是最为直接的方法。第一个被分离纯化的植酸酶来源于AspergillusterreusNo.9A-1，从此以后,陆续从十几种微生物中分离到植酸酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶，如枯草芽孢杆菌、假单孢杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、酵母、曲霉、隔孢伏革菌等，并对酶的生理生化性质进行了较深入的研究[8-11]。国内以中国农科院饲料所姚斌等为代表的研究者构建了上述饲料酶的大肠杆菌、毕赤酵母等高效表达系统，并迅速产业化[12]。利用转基因技术构建的毕赤酵母表达系统与液体深层发酵工艺相结合，大大拓展了饲料酶基因的来源，为提高饲料酶的产量和酶活提供了强大的技术支持。国家高技术研究发展计划(863计划)“饲料用酶的分子改良与产品研制”立足饲料行业对酶制剂的急需，组织中国农科院、吉林大学、华东理工大学、康地恩、挑战等科研单位与企业，在酶分子改良、高效表达、工程菌高密度发酵、饲料酶规模化生产与应用技术等方面联合攻关，通过分子改良，将满足饲料酶高比活、耐酸性、抗胃肠道蛋白酶等要求，预期木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、半乳糖苷酶在工程菌中表达量高于5g/L，发酵液效价分别达到100000IU/mL、50000IU/mL、8000IU/mL、5000IU/mL。植酸酶已成为21世纪世界公认的、最有前景的无公害饲用酶制剂。1999年植酸酶全球销售额为全部饲用酶制剂的49%。在德国和荷兰，超过90%的猪鸡饲料添加了植酸酶。欧美等国的植酸酶每年以20%左右的速度在递增，亚洲地区以每年80%~100%的速度在递增。中国是全世界首屈一指的饲料需求大国，2010年和2020年，中国的饲料需求量分别为3.4亿t和4.08亿t，植酸酶添加量以0.1‰计算，植酸酶纯蛋白的需求量应达到3.4~4.08万t以上，由此产生的直接经济效益每年将超过30亿人民币，具有良好的市场前景。二、液态酶的生产与后喷涂工艺酶作为一种蛋白质，对环境因素很敏感。温度、pH值、水分、强酸、强碱、紫外线和贮存过程等都会对酶活产生很大的影响。如上所述，分子改良的饲料酶基本适合饲料和消化道的作用环境，但随着大型饲料厂中越来越多地装备有强调质设备以及高温（80-150℃）短时加工设备。在饲料制粒、挤压和膨化过程中受温度、压力和水分的强烈作用下，酶制剂等热敏性微量组分的大部分活性都丧失了。康地恩检测深圳某公司提供的11个添加植酸酶的预混料样品，结果60天酶活平均降低50%。将酶制剂进行“包被”处理，制成微胶囊，减少了外界因素的影响，酶的热稳定性也有所提高，但液态酶后喷涂工艺由于高均匀度及避免高温蒸汽对酶活的不利影响，越来越普及，成为颗粒饲料生产必备的配套设备。KDN液态植酸酶、木聚糖酶、复合酶和后喷涂设备相配套，在六和、新希望、中惠、双胞胎、正邦、海新、粤星、永达、得利斯等国内主要大型饲料企业推广应用，能显著降低饲料成本，提高消化率，减少氮磷排放，受到饲料企业的欢迎，已经安装300余台，对饲料酶的普及应用具有重要的推动作用。1、理想的后喷涂设备要求①微量添加，高均匀度。用高压空气作载体，气液双料喷嘴，将微量（50-200ml/吨饲料）酶液充分雾化，弥漫包涂饲料颗粒；喷酶的颗粒饲料成品硬度无影响，水分几乎不增加；并辅设空气清洗系统，杜绝喷嘴处酶液滴漏问题。②自动化，高精确度。通过压力传感器连续测定干料流量，经PLC信息处理，自动控制酶蠕动泵流量，使酶的喷涂量准确跟踪干料流量变化。③兼容性好。多液仓，多泵，多喷嘴，适合多酶种以及其他液体添加剂喷涂。各液仓设置传感器，方便监控酶液用量和盘点。④触摸屏人机界面，总览全部过程，操作方便，参数设置简单，可根据饲料不同粒度选择相应的校正曲线。⑤加缓存仓，使颗粒干料流量稳定，均匀度提高。2、KDN-PPA液态酶后喷涂设备组成和工作原理KDN-PPA按照上述要求，采用最先进自动化控制技术研制而成，主要的电控件、泵、传感器、阀均采用国际名牌产品，确保产品运行可靠，计量准确。KDN-PPA设备的硬件由泵室、添加室、控制箱组成：①泵室含有液仓、液体流量测定装置、液泵等。②添加室含有颗粒饲料流量传感器、喷涂装置等。③控制箱含有PLC、触摸屏等。合格的饲料颗粒经分级筛进入缓冲仓（C），控制箱内的PLC收到仓料料位传感器（A）的有料输入信号，产生输出，给控制箱内颗粒饲料流量表启动信号，根据人为指定的目标流量（t/h）进行PID调节，相应打开添加室进料门（B），饲料靠自重流下，同时，安装在添加室内的喷涂电磁阀（D）打开，泵室根据触摸屏中指定的酶制剂流量（1/h）、酶泵的选择以及颗粒饲料流量表的开门信号启动，将高压空气和酶（E和F）按要求的流量和压力送到添加室，喷涂到颗粒料。3、高均匀度、高喷涂率饲料主要以固体和液体形态存在，各种原料混合方式无非三种方式：固-固、固-液、液-液。添加剂在颗粒饲料中分布均匀度受添加量、添加剂的粒度、颗粒饲料粒度、混合机性能等因素影响，设某原料的添加量为x（g/kg），添加剂颗粒度为y（粒/g），颗粒饲料粒度为z（粒/g），则每颗饲料含有原料的粒数为：如固体植酸酶x=0.1,y=1500,z=15，则2-3kg的高压空气，可以将0.1ml液体酶可以分散为0.8-6.4×106个雾滴。液体植酸酶x=0.1,y=3000000,z=15，则对已经安装的后喷涂设备进行了30多台次的均匀度检测，平均变异系数CV=13%，喷涂效率（喷涂颗粒实际酶活占理论值的比率）85%。而植酸酶颗粒剂直接混合到颗粒饲料中，则混合过程酶活从418IU/mL降到217IU/mL，73.5°C调质后降到114IU/mL，制粒后降到97IU/mL97，植酸酶的活性降低了75%，均匀度CV=39%（滨州六和实地测定数据）。4、高保存率在潍坊六和测定结果表明，植酸酶粉剂（5897u/g）4倍添加于饲料（400g/t），经高温制粒（75°C），残留酶活很低，仅50U/kg，与理论值2300u/kg和预期值500u/kg差距甚远。与后喷涂效果450u/kg差距也很大。由于液体酶喷涂于颗粒饲料表面，担心易脱落或不稳定。临沂六和模拟养殖场室外饲料筒仓处理：相对湿度75％，60℃保持10小时；37℃保持14小时交替处理，共处理10天，比较进口固体耐制粒植酸酶直接混合、KDN液体植酸酶后喷涂生产的颗粒饲料，分别存留41%和56%。5、液体酶生产KDN液态饲用复合酶棕褐色，澄清透明，经过稳定化处理，稳定性高，完全能满足饲料企业运输，贮存和生产需要。本品为生物活性物质，避光、密闭保存，低温4～10℃贮存，保质期半年。6、颗粒饲料中酶活测定方法由于饲料成分复杂，磷、糖类背景值高，用常规酶活测定方法难以准确测定，因此制约了酶制剂的推广。曾经一度形成无法比较粉酶、颗粒酶与液态酶效果的局面。康地恩在推行液态酶后喷涂工艺的同时，参考国外文献率先建立了颗粒饲料中植酸酶活性测定方法，在浸提饲料中植酸酶后，用超滤柱滤除游离磷酸根后，按照常规方法测定[13-14]。这对于指导新工艺的改进和普及起到重要作用。四、饲料酶的体外酶解评价动物饲养试验周期长，成本高，影响因素多，通过模拟家禽胃肠道环境，建立体外酶解评价体系，可以为饲料酶的使用提供试验依据。1、木聚糖酶对消化道的适应性采集国内不同企业生产的木聚糖酶，保存于4℃冰箱。按照KDN企业标准测定酶活（酶活力定义：1g酶粉于40℃，pH＝5.0条件下，每分钟水解木聚糖生成相当于1μg木糖还原物质，即为1个酶活力单位，以U/g表示）。胃蛋白酶耐受性分析：取上述酶的浸体液20ml，调pH2.6，加入90μl50mg/ml的胃蛋白酶，在40℃培养箱中温育1.5h，定容至25ml，经过适当稀释后测定残留酶活。胰蛋白酶耐受性分析：取上述酶的浸体液20ml，调pH6.5，加入45μl100mg/ml的胰蛋白酶，在40℃培