基因组DNA提取与PCR技术

基因组DNA提取与PCR技术李兆阳前言在基因工程和蛋白质工程中，核酸分子是这些技术应用所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是分子生物学研究中很重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。主要内容基因组DNA提取1、核酸的分类及理化性质2、几种核酸提取方法的基本原理及实例分析3、常见问题与对策核酸分为两大类脱氧核糖核酸（DNA）DeoxyribonucleicAcid核糖核酸（RNA）RibonucleicAcid。脱氧核糖核酸（DNA）DNA分子含有生物物种的所有遗传信息，分子量一般都很大DNA结构核糖核酸（RNA）RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达，分子量要比DNA小得多。RNA为单链分子。核酸的理化性质RNA核苷酸的纯品呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。核酸的理化性质天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等，从中分离DNA。核酸的理化性质DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。DNA提取的几种方法(1).浓盐法利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M氯化钠提取液抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积无水乙醇可将DNA钠盐沉淀出来.也可用0.15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异戊醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.（2）阴离子去污剂法SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸基因组DNA-SDS法以动物组织为例动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液（3）苯酚氯仿抽提法苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态.（4）水抽提法:利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M.加入2倍体积无水乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用70%、80%和95%乙醇洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品.几种方法的比较苯酚、氯仿抽提/醇沉淀方法是一个永不过时的方法。稳定、可靠、经济、方便。苯酚、氯仿抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品(杂质为蛋白质)，该方法完全可以获得高质量的核酸。关键：酚氯仿要混匀彻底，用量足够。浓盐法高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法，同样也是一个非常不错的方法。与酚氯仿抽提方法相比，纯度的稳定性可能要低一点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提。不足是纯度(蛋白质残留)不够稳定。水沉淀此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用.实例分析从鼠尾组织中提取基因组DNA鼠尾1cm次日上层溶液过夜消化酚、氯仿抽提75%乙醇洗涤离心沉淀无水乙醇空干TE溶解弃上清12000rpm10min12000rpm10min12000rpm10min4度保存PK、SSTE55度流程图1.DNA中含有蛋白、多糖、酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶切和PCR反应3.DNA中残留有金属离子1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发后再溶解。3.增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶切和PCR反应。原因对策1.材料不新鲜或反复冻融2.未很好抑制内源核酸酶的活性3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染5.反复冻融1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量3.操作应尽量轻柔4.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌5.将DNA分装保存于TE缓冲液中，避免反复冻融DNA提取常见问题问题二：DNA降解。对策原因1.实验材料不佳或量少2.破壁或裂解不充分3.沉淀不完全4.洗涤时DNA丢失1.尽量选用新鲜（幼嫩）的材料\适当增加用量.2.高温裂解时,时间适当延长，适当增加PK的用量。3.低温沉淀,延长沉淀时间4.注意动作轻柔,避免丢失。DNA提取常见问题问题三：DNA提取量少。对策原因DNA电泳图PCR技术1、PCR发展历史2、PCR原理及引物设计基本原则3、常见问题与注意事项4、PCR技术的发展PCR发展历史PCR的设想本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆目的片段”。PCR的实现1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件---模板DNA,引物,DNA聚合酶,合适的缓冲体系;DNA变性、复性及延伸的温度与时间。一、PCR的基本原理DNA的复制(replication)——由亲代DNA合成两个相同的子代DNA的过程。亲代DNA复制子代DNA基本原理：在模板、引物、4种dNTP和TaqDNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。基本步骤变性：加热使双链DNA变为单链退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应一、PCR的基本原理示意图Flash演示二、PCR引物设计PCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。1、引物长度一般为15~30个核苷酸。2、引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。尤其是引物的3′端不应有连续3个G和C。否则会使引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量在45~55%左右。设计引物时要考虑3′端和5′端引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54°C3、引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3′端的互补重叠。（一）PCR引物设计原则5、引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。6、引物3′端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3′端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。7、引物的5′端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子等。在PCR的起始反应中，引物5′端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以这种引物参与的PCR反应产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。（二）引物设计的方法现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，在线引物设计的网站有：–://genome-://bioinformatics.weizmann.ac.il/cgi-bin/primer/primer3.cgi;~urolab/methprimer/index1.html;×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ul标准的PCR反应体系PCR反应条件的控制PCR反应成分1.PCR反应的缓冲液：10-50mmol/LTris-Cl缓冲液，72℃时pH7.2,调节反应体系的pH值，使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。TaqDNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。在PCR反应中，Mg2+的总量应比dNTPs的浓度高。其原因是引物、模板、dNTP分子中的磷酸基团可与Mg2+结合而降低游离Mg2+浓度，从而影响TaqDNA聚合酶的活性。常用1.5mmol/L。2.镁离子浓度：1.5mmol/LdNTP溶液具有较强的酸性。使用时应用NaOH将pH值调至7.0-7.5，分装小管，于-20℃存放，过多冻融会使dNTP产生降解。在PCR反应中，dNTPs浓度在20-200μmol/L,dNTP浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，但可提高反应的特异性及实验的精确性。4种dNTP在使用时必须以等摩尔数浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。3.底物浓度：20-200μmol/L在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键的因素之一。PCR发明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow片段、T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，它们因对热的稳定性差而未得到广泛应用。直到耐热的DNA聚合酶(TaqDNApolymerase)应用于PCR反应，才使这一技术得到迅速发展和广泛应用。4.耐热DNA聚合酶：2.5-5uTaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶在75-80℃具有最高的聚合酶活性。75-80℃每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸，70℃时延伸速度在60个核苷酸/秒以上。55℃时为22个核苷酸/秒；37℃和22℃时分别为1.5个和0.25个核苷酸/秒。温度超过80℃时，合成速度明显下降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关。TaqDNA聚合酶没有3′→5′外切酶活性。没有校正功能。对于30次循环的PCR扩增反应。此酶的错配率为0.1%～0.25%。TaqDNA聚合酶体外扩增DNA的忠实性是所有已知忠实性的DNA聚合酶中最低的。因此在特别考虑扩增产物忠实性，推荐采用具有校对功能的其他耐热的DNA聚合酶。如Vent和PfuDNA聚合酶