L-丝氨酸酶法生产工艺放大试验_8

L-丝氨酸酶法生产工艺放大试验目录•概述•制药工艺路线及研究阶段•原材料及产品的主要技术规格•生产流程简述•发酵工艺放大优化•分离纯化放大与优化•产品的检验与分析•主要设备的计算•种子罐•发酵罐•离子交换罐研究内容：L-丝氨酸•概述L-丝氨酸是一种脂肪族极性α氨基酸。L-丝氨酸是组成蛋白质的常见20种氨基酸中的一种，是哺乳动物的非必需氨基酸，也是生酮氨基酸。在自然界中也有D-丝氨酸，如丝原蛋白中。在一些抗生素中也有D-丝氨酸。符号：S。•学名：2-氨基-3羟基丙酸。•英文名：L-Serine，缩写：L-Ser，•分子式：C3H7NO3，结构式：CH2OHCH(NH2)COOH，分子量：105.09。•结构式：•药理作用：•磷脂酰丝氨酸补充剂能增加大脑皮层中的神经传递质乙酰胆碱的产量，乙酰胆碱与思维、推理和注意力集中有关联。磷脂酰丝氨酸也能刺激多巴胺的合成和释放。磷脂酰丝氨酸似乎和大脑对压力的反应有关联。一项临床研究发现，在针对健康人施加压力的实验中，服用磷脂酰丝氨酸的人群对于压力的反应要比其他人群低。压力反应是通过衡量血液中促肾上腺皮质激素水平得出的，促肾上腺皮质激素是由脑下垂体分泌的一种激素，它随之促进肾上腺分泌应激激素皮质醇。磷脂酰丝氨酸主要用于治疗痴呆症（包括阿兹海默症和非阿兹海默症的痴呆）和正常的老年记忆损失。国内外的生产情况•L-丝氨酸的主要生产方法有以下四种。•蛋白质水解法：L-丝氨酸在丝胶蛋白中的含量丰富，蚕茧衣中含量为13.64%，因此，可用水解蚕茧衣制取。•添加前体发酵法：L-丝氨酸在生物体内代谢运转速度极快，直接发酵法生产困难。一般采用添加前体的发酵法。添加的前体主要有甘氨酸、甘氨酸三甲内盐或甘油酸，其中以甘氨酸为前体的已工业化。产生菌可分为两类：异养型和甲基营养型细菌。•化学合成法：DL-丝氨酸可有以羟基乙醛为原料的合成法等，然后再拆分得L-丝氨酸。•酶法：利用丝氨酸羟甲基转移酶催化甲醛和甘氨酸（Gly）可逆的合成L-Ser，反应过程中SHMT需PLP和四氢叶酸（THFA）作为其辅因子，由于主要原料来源广泛、价格低廉，并可合成高浓度的产物，因此该法是目前最有应用前景的L-Ser生产方法。•鉴于化学合成法和酶法各自的优势,可将二者结合起来,即先用化学合成法制备出DL-丝氨酸,将其氨基乙酰化,再用固定化酶法进行拆分。现用于氨基酸拆分的酶主要是氨基酰化酶,通常将酶固定在DEAE-葡聚糖凝胶A-25、碘乙酰纤维素或聚丙烯胺凝胶上。将固定化酶均心地装入柱内,底物(乙酰化氨基酸)溶液在合适的柱温、pH条件下以一定的速度通过酶柱即可。过程如下：7用途与发展前景•L-丝氨酸虽属于非必需氨基酸但具有许多重要的生理功能和作用,因此,在医药、食品、化妆品中均有较为广泛的应用。丝氨酸是重要的自然保湿因子(NMF)之一,皮肤角质层保持水分的主要角色,因此是很多高级化妆品中的关键添加剂,只是因其价格限制了它在化妆品中的应用。•L-丝氨酸广泛用于配置第三代复方氨基酸输液和营养增补剂，并用于合成多种丝氨基酸衍生物，如心血管、抗癌、爱滋病新药及基因工程用保护氨基酸等。•抗衰老作用。•食品：L-丝氨酸用于运动饮料、氨基酸减肥饮料等。•饲料：L-丝氨酸用于动物饲料，可促进动物生长发育；制备工艺路线发酵过程•原材料及产品的主要技术规格•培养基：LB培养基•蛋白胨10g•酵母浸出液5g•氯化钠5g水1L•发酵流程•1.将LB培养基共0.25m3放入0.3m3的种子罐配料罐中，待搅拌均匀后，用泵打入种子罐中，种子罐用138℃水蒸气进行夹套加热灭菌（使培养基从25℃升至121℃），再用冷却水使之冷却到37℃，接入菌种后培养到对数期待用。2019/10/4•2．在12m3的发酵罐配料罐中加入8.35m3的LB培养基，开启搅拌待混匀后，用泵打入发酵罐中，进行灭菌，用138℃水蒸气先进行间接加热（使培养基从25℃升至90℃），再用蒸汽直接加热（使培养基从90℃升至121℃），然后用冷却水使之冷却到37℃，待用。•3.将种子罐中的料液放入发酵罐中发酵14h，再用离心机进行离心分离，收集菌体，废液放入贮罐中。2019/10/4发酵放大主要过程示意图2019/10/4•生产原料•氢氧化钠溶液用量66040L浓度1M•盐酸用量66040LpH=2•无水乙醇用量2080L•去离子水用量99060L•717型离子交换树脂用量49530L•产品的主要技术规格•生产规模：80吨/年•生产方法：717型离子交换树脂离子交换层析后，进行浓缩，之后添加乙醇结晶，离心分离•生产天数：300天•生产周期：1天•生产方式：间歇生产分离纯化所需原材料及产品的主要技术规格•生产流程简述:•本设计采用离子交换层析对两种氨基酸（L-丝氨酸和L-甘氨酸）进行分离。•基本流程：•反应液→离子交换层析→浓缩→结晶→过滤干燥→产品•反应过程:发酵结束后收集菌体，菌体沉淀中加入蒸馏水制成菌悬液，细胞破碎后加入5-磷酸吡哆醛（PLP，终浓度为2mmol/L），37℃温育24h。然后加入四氢叶酸（终浓度为25mmol/L）、甘氨酸（终浓度为2mol/L）、37％的甲醛溶液（终浓度为50mmol/L）进行酶反应72h2019/10/4•离子交换层析过程•采用717型离子交换树脂，将其装入离子交换罐，保证其密实。然后用氢氧化钠水溶液处理（溶液浓度为1M，体积为66040L）使离子交换柱呈碱性，处理完之后上样。上样后，L-丝氨酸和L-甘氨酸吸附在交换树脂上，可用酸性溶液洗脱，本设计采用pH=2的Hcl溶液洗脱，用量为66040L，洗脱前需要用去离子水洗涤，最终可得氨基酸溶液为16510L，其中L-丝氨酸为6934L。•结晶过程•离子交换层析完毕后，对料液进行浓缩。采用蒸汽加热，可将料液浓缩至原体积的1/10。•浓缩过程：•待浓缩液冷却后，加入208L无水乙醇，使L-丝氨酸结晶，最后离心烘干可得产品267kg/天。年操作日为300天。•简述:717型离子交换树脂→装入离子交换罐→用氢氧化钠溶液处理→上样→用去离子水洗涤→用Hcl溶液洗脱→浓缩→冷却→加入无水乙醇→结晶→离心过滤→烘干→产品2019/10/4•工艺分离•生产条件:•已知L-丝氨酸的小试纯化工艺为：717型离子交换树脂用1M的NaOH溶液处理成OH-型，水洗至中性后装柱（三根Φ25×500mm的柱子）。对第一根柱子上样，上样结束后水洗。然后连接另2根柱子，用pH=2的Hcl洗脱，分别收集只含L-丝氨酸、L-甘氨酸，以及同时含这两种氨基酸的洗脱液。假设一个柱子的体积为V，已知NaOH溶液用量为4V，洗涤水用量为2V，洗涤液用量为4V，其中含氨基酸的洗脱液体积为1V，含L-丝氨酸的洗脱液体积为0.42V。将含L-丝氨酸的洗脱液浓缩液浓缩至原体积的1/10，加入3倍体积的无水乙醇，将晶体（湿含量15%）离心烘干，L-丝氨酸的分离得率为77%。年操作日300天，生产方式：间歇生产。•水蒸气138℃，冷却水由27℃进，37℃出。•物料衡算•已知柱子Φ25×500mm，一个柱子的体积为V，已知NaOH溶液用量为4V，洗涤水用量为2V，洗涤液用量为4V，其中含氨基酸的洗脱液体积为1V，含L-丝氨酸的洗脱液体积为0.42V。将含L-丝氨酸的洗脱液浓缩液浓缩至原体积的1/10，加入3倍体积的无水乙醇，将晶体（湿含量15%）离心烘干，L-丝氨酸的分离得率为77%。年操作日300天。2019/10/4•离子交换罐•小试生产时：g539.2105024178.0024178.077.00314.0mol0314.0157.02.0V2.0157.0157000500220V-L32得丝得丝甘丝mmolnnnLmmL放大后：2019/10/4L95761651058.0V58.0VL69341651042.0V42.0VL99060165106V6VL16510VVL66040165104V4VL66040165104V4105160mL495303105160157.0V105160539.251067.251067.2t267.030080HclNaoHV放大甘放大丝放大水放大样品放大放大放大倍数放大总放大倍数丝记：倍gm•浓缩罐：•离心机：•能量衡算：查表得：L4.6936934101V101V丝丝，缩2080.2L693.43V3V丝，缩乙醇KgCKKgKJCmp/KJ2258100)/(2.4C10011,水的气化潜热：水的比热容：KgKJCKKgKJCmp/2116:138)/(901.1C13822,水蒸气的气化潜热水蒸气的比热容：•浓缩罐•采用间接蒸汽加热至沸腾（加热蒸汽为138℃）•根据能量守恒定律得：•其中：•代入公式：•求得:•ƞ=5%~10%，取10%•即:水蒸气的估计用量为7341Kg.21121,109C水蒸气水物mmTTmmp7281Kg1000105165100.269346934Kg16934水物水丝水丝物mVmmmm21166934109225827-1002.47281水蒸气mgmK6674水蒸气gmmK734166741.11.1水蒸气蒸汽，实•冷却器•假定物料冷却至37℃•根据能量守恒定律得：•其中•ƞ=5%~10%，取10%121mp,321mp,CCttmTTm冷凝水料Kgmmm10401000105165102.06934101101丝氨酸水料2737371001040冷凝水mKgm5512冷凝水得：Kgm606355121.1冷凝水，实•主要设备的计算•离子交换罐的计算•选择反吸附离子交换罐•已知离子交换树脂总体积：•离子交换罐高径比（H/D）为3，即•树脂层高度占圆筒高度的50%,即•圆整得•浓缩罐设计•进料体积：6934T•选择搪玻璃蒸发器10m3HG5-38-79L49530V放大总3/DHL49530V4DH5.02放大总3.47m34.7dmD10.5m3DH3.5mD•冷却器•假设冷却时间为0.5h,即t=0.5h•查表得•换热系数：K=830~1250kJ/(m2·h·℃)取K=1000kJ/(m2·h·℃)•对数平均温度•根据换热面积选型得列管式石墨换热器HG5-1320-80•换热面积为20.7m2•有效管长为4000mm•根数为61•筒径为400mmCtTtTtTtTmt8.28273737100ln273737100ln23122312AmttKATTm8.285.01000371002.41040C321mp,料211.19mA•离心机•已知离心机分离物料为固液混合，所以采用过滤离心机.•其中•所以离心机所需容积•假设离心分5次进行，则每次进料量为554.7L•其中丝氨酸浓缩液每次进料138.7，乙醇进料416L。•选用SS1800过滤离心机•其转速为510r/min•有效容积为660L•过滤面积为2.7m2•外形尺寸为L2.20804.6933V3V丝，缩乙醇L6.27732.20804.693VVV,乙醇缩丝离心机mm120018002350储罐：高位槽•①NaOH总体积为66040L，分3个高位槽安放。•选型为F25000HG/T2374-98•公称容积为25000L•实际容积为27790L•直径D为2800mm•高度H为5379mm•液位计直径为65/50mm•②HCl总体积为66040L，分3个高位槽安放。•选型为F25000HG/T2374-98•公称容积为25000L•实际容积为27790L•直径D为2800mm•高度H为5379mm•液位计直径