庆大霉素的生产工艺

氨基糖苷类庆大霉素吕美珍裴聪赵焕平王佳佳任永成2012.5.24庆大霉素一.氨基糖苷类的总述二.庆大霉素1.概述-结构与性质2.药代动力学3.制备原理4.工艺路线5.工艺过程6.代谢调控7.最新成果氨基糖苷类的总述氨基糖苷类抗生素（Aminoglycosides）是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素。有来自链霉菌的链霉素等、来自小单孢菌的庆大霉素等天然氨基糖苷类，还有阿米卡星等半合成氨基糖苷类。虽然大多数抑制微生物蛋白质合成的抗生素为抑菌药，但氨基糖苷类抗生素却可起到杀菌作用，属静止期杀菌药。氨基糖苷类抗生素可起到杀菌作用，属静止期杀菌药。其杀菌作用具有如下特点：1.杀菌作用呈浓度依赖性。2.仅对需氧菌有效，尤其对需氧革兰阴性杆菌的抗菌作用强。3.具有明显的抗生素后效应。4.具有首次接触效应。5.在碱性环境中抗菌活性增强。庆大霉素的概述庆大霉素是中国独立自主研制成功的广谱抗生素，是产生于无产阶级文化大革命中的科技成果。它开始研制于1967年，成功鉴定在1969年底，取名“庆大霉素”，意指庆祝“九大”以及庆祝工人阶级的伟大。庆大霉素[Gentamicin，正泰霉素（gentamycin）]系从放线菌科单孢子属发酵培养液中提得，系碱性化合物，是目前常用的氨基糖苷类抗生素。庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素,主要用于治疗细菌感染，尤其是革兰氏阴性菌引起的感染。庆大霉素能与细菌核糖体30s亚基结合，阻断细菌蛋白质合成。庆大霉素是为数不多的热稳定性的抗生素，因而广泛应用于培养基配置。庆大霉素是由绛红小单孢菌、棘孢小单孢菌等发酵产生的氨基糖苷类抗生素,是由22脱氧链霉胺、绛红糖胺、加拉糖胺组成的多组分混合物,并以C族复合物为主。22脱氧链霉胺分别在4、6位上通过苷键连接绛红糖胺和加拉糖胺,因绛红糖胺C6c上的甲基化程度不同,形成了C1、C2、C1a3个主要组分,其结构如图所示。这3个组分中,C1、C2、C1a的疗效和毒性互不相同:C1组分毒副作用最小且不易产生耐药性,但疗效稍差;C2和C1a组分疗效高,但毒性较大且容易产生耐药性。性状：常用其硫酸盐，为白色或类白色结晶性粉末；无臭；有引湿性。在水中易溶，在乙醇、乙醚、丙酮或氯仿中不溶。药代动力学一.功能主治对大肠杆菌、产气杆菌、克雷白杆菌、奇异变形杆菌、某些吲哚变形杆菌、绿脓杆菌、某些奈瑟菌、某些无色素沙雷杆菌和志贺菌等革兰阴性菌有抗菌作用。革兰阳性菌中，金黄色葡萄球菌对该品敏感；链球菌对该品耐药。厌氧菌、结核杆菌、立克次体、病毒和真菌亦对该品耐药。近年来，由于该品的广泛应用，耐药菌株逐渐增多，绿脓杆菌、克雷白杆菌和沙雷杆菌、吲哚阳性变形杆菌对该品的耐药率甚高。对金葡菌及大肠杆菌，产气杆菌，奇异变形杆菌，绿脓杆菌等G－菌作用较强。适用于敏感细菌所致的新生儿脓毒症、败血症、中枢神经系统感染（包括脑膜炎）、尿路生殖系统感染、呼吸道感染、胃肠道感染（包括腹膜炎）、胆道感染、皮肤、骨骼、中耳炎、鼻窦炎、软组织感染（包括烧伤）、李斯特菌病。二.药物的相互作用1.与其他氨基糖苷类合用或先后连续应用，可增加耳毒性、肾毒性以及神经肌肉阻滞作用的可能性。与神经肌肉阻滞药合用，可加重神经肌肉阻滞作用。2.与卷曲霉素、顺铂、依他尼酸、呋塞米或万古霉素等合用或先后连续应用，可增加耳毒性与肾毒性的可能性。3.与头孢噻吩合用可能增加肾毒性。4.与多粘菌素类合用或先后连续应用，可增加肾毒性和神经肌肉阻滞作用。5.其他肾毒性及耳毒性药物均不宜与该品合用或先后连续应用，以免加重肾毒性或耳毒性。三.动力学肌注后吸收迅速而完全。局部冲洗或局部应用后亦可经身体表面吸收一定量。吸收后主要分布于细胞外液，其中5～15%再分布到组织中，在肾皮质细胞中积蓄，该品可穿过胎盘分布容积为0.2～0.25L/kg(0.06～0.63L/kg)。尿液中药物浓度高。支气管分泌物、脑脊液、蛛网膜下腔、眼组织以及房水中含药量少。蛋白结合率低或很低。肌内注射或静脉滴注后30～60分钟血药浓度达峰值，成人肌注后的血药峰浓度(μg/ml)一般为按体重肌注剂量(mg/kg)的4倍，静滴完毕后可达4～6μg/ml，婴儿单次给药2.5mg/kg后可达3～6μg/ml；发热或大面积烧伤患者，血药浓度可能有所降低。T1/2成人为2～3小时，肾功能衰退者40～50小时。发热、贫血、严重烧伤患者或合用羧苄青霉素的患者T1/2可能缩短；但在妇科、外科及烧伤的不同患者间有很大差异。小儿T1/2为5～l1.5小时，体重轻的T1/2较长。该品在体内不代谢，经肾小球滤过排出，尿中浓度可超过100μg/ml，24小时内排出50～93%。新生儿出生3天以内者，给药12小时内排出10%；新生儿出生5～40天者给药12小时内排出40%。血液透析与腹膜透析可从血液中清除相当药量，使T1/2显著缩短。四.适合症状①该品适用于绿脓杆菌、变形杆菌(吲哚阳性和阴性)、大肠杆菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、枸橼酸杆菌属以及葡萄球菌(包括耐青霉素(G)与耐甲氧西林菌株)所致的新生儿脓毒症、败血症、中枢神经系统感染(包括脑膜炎)、尿路生殖系统感染、呼吸道感染、胃肠道感染(包括腹膜炎)、胆道感染、皮肤、骨骼、中耳炎、鼻窦炎；软组织感染(包括烧伤)、李斯特菌病；②该品用于绿脓杆菌或葡萄球菌所严重中枢神经系统感染时(脑膜炎、脑室炎)，可同时用该品鞘内注射作为辅助治疗；③该品不适用于单纯性尿路感染初治，除非病原菌对其他毒性较低的抗菌药物不敏感，该品对链球菌中的多数菌种(尤其D组)、肺炎球菌和厌氧菌(如类杆菌属或梭状芽胞杆菌属)无效；④该品口服可用于肠道感染或结肠手术前准备，也可用该品肌注合并克林霉素或甲硝唑以减少结肠手术后感染率。五.使用剂量成人肌肉注射或稀释后静脉滴注，一次80mg(8万单位)，一日2—3次，间隔8小时。或按体重1一1.7mg/kg(以庆大霉素计，下同)。每8小时1次；或按体重0.75一1.25mg/kg，每6小时1次，共7一10日。小儿按体重每日3—5mg/kg，分2—3次给药。血液透析后，可根据感染严重程度，成人按体重补给一次剂量1—1.7mg/kg；小儿按体重补给2—2.5mg/kg。注意事项(1)应监测血药浓度，尤其在新生儿、老年和肾功能不全的患者。庆大霉素的有效治疗浓度范围为4一10μg/ml。应避免高峰血药浓度持续在12μg/ml以上和谷浓度超过2μg/ml。但外科、妇科、产科或烧伤患者由于个体差异较大，按计算剂量可能低于最小常用量或超过最大常用量。接受庆大霉素鞘内注射者应同时监测脑脊液内药物浓度。(2)不能测定血药浓度时，应根据测得的肌酐清除率调整剂量。(3)患者应给予充足的水分，以减少肾小管损害。(4)长期应用可能导致耐药菌过度生长。(5)给予首次饱和剂量(1一2mg/kg)后，有肾功能不全，前庭功能或听力减退的患者所用维持量应酌减：剂量不变，延长给药间隔时间；或给药间期不变，每次剂量减少或停用庆大霉素，其维持量可按下式计算：①延长给药间期(小时)，每次剂量不变(1一2mg/kg)，给药间期=患者血肌酐值(mg/100ml)×8或②减少维持剂量，每8小时给药一次：每次剂量=患者体重（kg）×常规用量（mg/kg）/患者血肌酐值(mg/100ml)。由于庆大霉素在体内不代谢，主要经尿排出，因此肾功能减退的患者中可能引起药物积聚达中毒浓度。不良反应(1)曾有报道庆大霉素全身应用合并鞘内注射时引起腿部抽搐、皮疹、发热和全身痉挛等。庆大霉素引起肾功能减退的发生率较妥布霉素为高。大剂量用药容易导致水肿(2)发生率较多者有听力减退、耳鸣或耳部饱满感(耳毒性)、血尿、排尿次数显著减少或尿量减少、食欲减退、极度口渴(肾毒性)、步履不稳、眩晕(耳毒性，影响前庭；肾毒性)。发生率较低者有呼吸困难、嗜睡、极度软弱无力(神经肌肉阻滞或肾毒性)。(3)停药后如发生听力减退、耳鸣或耳部饱满感，需引起注意。不良反应与卡那霉素进近似，用量小时反应较轻.如用量大，疗程长，偶见肠道菌群紊乱，一旦出现即停药，可恢复正常.可有白细胞减少，听力及肾损害.个别病例口周、面部和四肢皮肤发麻，眩晕,耳鸣.偶有过敏性休克，主要症状为呼吸道阻塞及循环障碍、半数以上病例经抢救无效而死亡，故有人认为该品的最严重的不良反应为速发型过敏性休克.可引起罗姆伯格氏症(闭目难立，暗处和洗脸时站不稳)中毒症状。耐药机制1、产生钝化酶：如磷酸化酶、腺苷化酶、乙酰化酶。2、细胞膜通透性下降。3、修饰靶蛋白（p10蛋白）。缺乏主动转运功能：如厌氧菌对氨基糖苷类的耐药性。制备原理庆大霉素的生产是采用五级发酵形式，离子交换树脂的方法进行产品的分离精制。庆大霉素产生菌绛红小单孢菌或棘孢小单孢菌经孢子制备、摇瓶菌丝培养后接入种子罐，种子经过一级、二级、三级、四级扩级培养后接入发酵罐。发酵过程中控制温度、通气量、pH、补料等各项工艺参数，4~6天发酵结束。发酵产物经阳离子交换树脂吸附、洗脱、脱色、浓缩和干燥可得庆大霉素成品。硫酸庆大霉素工艺流程发酵用小单胞菌一级种子罐二级种子罐三级种子罐四级种子罐酸化中和交换分离漂洗产品浓缩喷雾干燥成盐脱色压滤洗涤洗脱脱色无菌接入培养48小时左右，pH自然，36-37℃培养24小时左右，pH6.8-7.4培养24小时左右，pH6.7-7.4培养4天，34-35℃洗脱收率≥98%浓缩收率≥88%炭脱收率≥95%调pH至5.0-5.8喷速：20-80L/h进塔温度：116-135℃喷雾收率≥90%酸化、中和加树脂吸附发酵液分离阳离子交换柱饮用水疏松稀酸洗0.05M盐酸、0.02M氯化铵除钙离子、镁离子纯化水冲洗除氯离子0.08-0.12M稀氨洗1:20VVM-1:40VVM除蛋白质等杂质调节pH值至碱性pH8.5-94.5%-5.3%浓氨洗脱解析收集旋光效价1000u/mL经阳串阴管道进入阴离子交换柱9500-12000L酸洗、碱中和再生树脂低单位洗脱液贮罐旋光效价200-1000u/mL3000-4000L作阳离子交换柱洗脱液回收、氨捞（再吸附)酸化罐树脂分离器饱和树脂漂洗柱漂洗高单位洗脱液脱色解析完毕后水洗使树脂再生压回酸化罐旁的树脂计量槽需要时通空气赶气泡加入浓氨水洗脱液贮罐送入浓缩车间阴离子交换树脂再生含部分庆大霉素的洗脱液流速1：100-150VVM工艺过程(一)菌种生产中国内常用绛红小单孢菌，国外常用棘孢小单孢菌、橄揽星小单孢菌。对菌种进行诱变选育，采用的方法有紫外线、离子辐射、N离子注入、微波处理、DES化学法等。另外，近年来，随着分子生物学技术的发展以及在微生物基因组计划的推动下，国内外对放线菌的抗生素合成、调控和转运基因已经进行了大量卓有成效的研究，因此，通过对庆大霉素生物合成基因的克隆与转移来提高其增产是很有发展前景的。（二）孢子制备和种子培养1.孢子制备孢子萌发培养基(%):1号培养基:K2HP40.01,NaCl0.05,MgSO40.05,葡萄糖0.1,小麦汁2.0;2号培养基:K2HP40.01,NaCl0.05,MgSO40.05,小麦汁2.0;3号培养基:NaCl0.05,MgSO40.05,小麦汁2.0.孢子萌发的影响条件1、pH值：当小单孢菌发酵培养基起始pH7.0时,菌丝生长快,庆大霉素合成起步早,产抗期延长.同样是5天的周期,而它的发酵水平最高.说明庆大霉素代谢合成最适pH值比孢子萌发pH值略高.2、温度的影响：温度是孢子萌发的重要条件,它影响萌发的速度和百分率.菌株培养温度由30→34℃时,萌发率相差几倍.当温度由34→36℃,大部份菌株发芽率达最大值,最适温度为36℃.3、溶氧对孢子萌发的影响：溶氧对孢子萌发也是不可缺少的因素.振荡培养12h的萌发率相当于静止培养17h的状况.以相同的培养时间,前者比后者萌发率提高30%～45%.振荡培养17h,萌发率高达41%～60%.4、孢子的密度与萌发的关系：当等量培养液中接入不同量的孢子时,萌