氨基酸生产(3)

25氨基酸发酵工艺25.1概述25.2氨基酸发酵的代谢控制25.3氨基酸发酵的工艺控制25.4谷氨酸生产工艺25.5赖氨酸生产工艺简介25.1概述近40多年来，国内外在研究、开发和应用氨基酸方面均取得重大进展，新发现的氨基酸种类和数量已由20世纪60年代50种左右，发展到20世纪80年代的400种，目前已达1000多种。其中用于药物的氨基酸及氨基酸衍生物的品种达100多种。氨基酸分为两大类，即蛋白质氨基酸和非蛋白质氨基酸。氨基酸中有8种氨基酸人体本身不能合成，只能从食物的蛋白质中摄取，称为必需氨基酸，它们是L-赖氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸和L-蛋氨酸。还有两种半必需氨基酸，即精氨酸和酪氨酸。25.1概述25.1.1氨基酸的应用1、食品工业：营养强化剂；鲜味剂；甜味剂。2、饲料工业：营养强化剂。3、医药工业：氨基酸输液；氨基酸衍生物；氨基酸盐。4、化学工业：洗涤剂；护肤品；人造革。5、农业：无公害农药。25.1概述氨基酸的应用食品工业：强化食品：谷物中缺赖氨酸，苏氨酸，色氨酸、蛋氨酸。增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸。甜味剂：苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂(α-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品1981年获FDA批准,现在每年产量已达数万吨。25.1概述氨基酸的应用食品工业：大豆蛋白的氨基酸组成影响其营养效价。25.1概述氨基酸的应用医药工业：多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。25.1概述氨基酸的应用饲料工业：不可缺少的营养性添加剂，一般生长期添加赖氨酸，产蛋期添加蛋氨酸，饲料配制时必需计算氨基酸平衡。25.1概述氨基酸的应用化学工业十二烷基谷氨酸钠肥皂-无皮肤刺激洗涤剂焦谷氨酸钠-润肤剂聚谷氨酸人造革、人造纤维和涂料25.1概述氨基酸的应用农业特殊的氨基酸农药如N-月桂酰-L-异戊氨酸，能防治稻瘟病，又能提高稻米的蛋白质含量。氨基酸烷基酯及N-长链酰基氨基酸能提高农作物对病害的抵抗力，具有和一般杀虫剂一样的效果。25.1概述25.1.2氨基酸的生产方法1、发酵法（1）直接发酵第一类用野生菌株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸，如谷氨酸、丙氨酸和缬氨酸。第二类用营养缺陷型突变株直接由糖和铵盐发酵生产氨基酸，如谷氨酸棒状杆菌的高丝氨酸缺陷型生产赖氨酸；酪氨酸缺陷型生产苯丙氨酸；苯丙氨酸缺陷型生产亮氨酸；亮氨酸缺陷型生产缬氨酸。25.1概述氨基酸的生产方法第三类用抗氨基酸结构类似物突变株，如利用乳糖发酵短杆菌的S-(2-氨基乙基）-L-半胱氨酸（AEC,赖氨酸结构类食物）抗性菌株生产赖氨酸。利用黄色短杆菌的5-甲基色氨酸（5-MT，酪氨酸结构类似物）抗性菌株生产酪氨酸。第四类抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株，如利用乳糖发酵短杆菌的抗AEC腺嘌呤、鸟嘌呤缺陷型生产赖氨酸。营养缺陷型回复突变株发酵。（2）添加前体的发酵：通过添加氨基酸的前体或中间产物，以避免生物合成途径中的反馈抑制，如以吲哚为前体，利用麦角菌生产色氨酸。25.1概述氨基酸的生产方法2、酶法：利用酶来制造氨基酸。应用完整菌体或从微生物细胞抽提的酶类合成氨基酸。天冬氨酸已于1973年应用完整菌体固定化进行生产，这是世界上最早应用固定化菌体的例子。赖氨酸、色氨酸、丙氨酸也可以生产。25.1概述3、提取法：蛋白质水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。4、合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸，蛋氨酸和甘氨酸现在仍大量应用合成法。传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高,工艺复杂,难以达到工业化生产的目的。近年来，由于微生物代谢调控理论的研究，使得大部分氨基酸得以发酵生产。25.1概述25.1.3氨基酸的国内外生产概况日本和德国为世界主要氨基酸生产国。日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸，可直接用于输液制剂的生产。日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家，生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。25.1概述氨基酸的国内外生产概况国内生产主要氨基酸生产厂：天津氨基酸公司、湖北八峰氨基酸公司生产规模及产品质量与国外大厂有较大差距。在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术，1991年销售量为二千万瓶，1996年达六千万瓶，主要厂家有无锡华瑞，北京费森尤斯，昆明康普莱特，但生产原料都依赖进口。反馈调节作用1、终产物反馈阻遏和反馈抑制野生型菌株“A”氨基酸合成操纵子模型ARPOA结构基因无活性repressorARNA聚合酶反馈阻遏活性A合成酶系（E1,E2…）A反馈抑制超过生理需要量野生型菌株酶合成水平的反馈阻遏25.2氨基酸发酵的代谢控制与育种野生型菌株酶活性水平的反馈抑制过量A作用效应物位点，酶构型变化，影响酶活性中心而失活Gene编码酶效应物位点过量A酶活中心反馈阻遏与反馈抑制比较反馈阻遏反馈抑制控制对象酶合成酶活性控制量终产物浓度终产物浓度控制水平转录水平酶构象变化控制装置终产物与阻遏蛋白亲和终产物与控制酶构象的部位亲和控制装置的动作阻遏蛋白与操纵子基因结合,不转录mRNA酶构型变化，活性中心失活形成控制开关控制酶活性大小控制反应迟缓，粗控制迅速，精控制细胞经济超高效益高效益2、解除反馈阻遏、反馈抑制突变株的选育野生型菌株诱变解除反馈调节突变株AR-或AO-AR-＋AO-酶基因突变解除反馈调节突变株可以大量积累末端产物筛选方法：解除Lys反馈调节突变株筛选野生型菌株诱变菌细胞正常反馈调节型解除反馈调节突变型25.2.1氨基酸生物合成的调节机制25.2.1.1反馈抑制与优先合成ABCDE反馈抑制反馈阻遏氨基酸生物合成调节机制的基本模式25.2氨基酸发酵的代谢控制与育种25.2.1氨基酸生物合成的调节机制氨基酸生物合成的基本调节机制有反馈控制和在合成途径分支点处的优先合成。反馈控制机制如上图，催化合成途径最初反应A→B的初始酶受终产物E的反馈抑制，同时，合成途径上各种酶的合成受终产物E的阻遏。25.2.1氨基酸生物合成的调节机制在途径分支点处优先合成的调节机制如下图，在分支点后，其中的一个终产物E优先合成，优先合成的关键酶，即催化C→D反应的酶受E的反馈控制，催化A→B共用酶受第二个终产物G的反馈控制。首先，E比G优先合成，E过剩时，反馈抑制C→D反应的酶，转换为合成G。G过剩时，催化A→B反应的酶，就会为G所控制。假如人为让特定氨基酸如G过剩，就会因E的合成不足而影响细菌生长。ABCDEFG优先合成反馈抑制在合成途径分枝点处的优先合成25.2.1.1其他特殊的控制机制1.多终产物控制催化分支合成途径共同部分的初始酶，在仅一种氨基酸终产物过剩时，完全不受或微弱或部分地反馈抑制（或阻遏），只是在多数终产物共存下才强烈地控制。有以下几种情况：①协同（或多价）反馈抑制：协同反馈抑制：指分支代谢途径中的几个末端产物同时过量时才能抑制共同途径中的第一个酶的一种反馈调节方式②合作（或增效）反馈抑制：系指两种末端产物同时存在时，可以起着比一种末端产物大得多的反馈抑制作用。③同功酶控制：同功酶是指能催化相同的生化反应，但酶蛋白分子结构有差异的一类酶，它们虽同存于一个个体或同一组织中，但在生理、免疫和理化特性上却存在着差别。同功酶的主要功能在于其代谢调节。在一个分支代谢途径中，如果在分支点以前的一个较早的反应是由几个同功酶所催化时，则分支代谢的几个最终产物往往分别对这几个同功酶发生抑制作用而不致过剩④积累反馈抑制：每一分支途径的末端产物按一定百分率单独抑制共同途径中前面的酶，所以当几种末端产物共同存在时，它们的抑制作用是累积的。2、顺序反馈抑制：当E过多时，可抑制C→D，这时由于C的浓度过大而促使反应向F、G方向进行，结果又造成了另一末端产物G浓度的增高。由于G过多就抑制了C→F，结果造成C的浓度进一步增高。C过多又对A→B间的酶发生抑制，从而达到了反馈抑制的效果。这种通过逐步有顺序的方式达到的调节，称为顺序反馈抑制顺序控制：ABCDEFGABCD3.平衡合成：经分支合成途径生产两种终产物E和G，E和G取平行合成。E优先合成，E过剩时，反馈控制与优先合成有关的催化C→D的酶，转而合成G。G过剩时，可逆转E的反馈控制，即E的反馈控制为G所抑制，又转为优先合成E。BCDEFG×4.代谢互锁：从生物合成途径看，是受一种完全无关的氨基酸的控制。它只是在很高浓度下（与生理学浓度相比）才能体现抑制作用，而且是部分性的抑制（阻遏）作用。25.2氨基酸发酵的代谢控制与育种1、控制发酵的环境条件氨基酸发酵受菌种的生理特性和环境条件的影响，对专性需氧菌来说环境条件的影响更大。谷氨酸产生菌因环境条件的影响会引起发酵的转换，生成各种不同的产物。25.2.2生产中代谢控制的措施25.2氨基酸发酵的代谢控制溶解氧：乳酸或琥珀酸←→谷氨酸←→α－酮戊二酸（通气不足）（适中）（通气过量、转速过快）NH4+：α－酮戊二酸←→谷氨酸←→谷酰胺（缺乏）（适量）（过量）pH：谷酰胺，N－乙酰谷酰胺←→谷氨酸（pH5－8，NH4+过多）（中性或微碱性）磷酸：缬氨酸←→谷氨酸（高浓度磷酸盐）生物素：乳酸或琥珀酸←→谷氨酸（过量）（限量）25.2氨基酸发酵的代谢控制2、控制细胞渗透性代谢产物的细胞透性是氨基酸发酵的重要因素，只有使细胞内的氨基酸渗透到细胞外，才能大量积累氨基酸。（1）生物素、油酸和表面活性剂，引起细胞膜的脂肪酸成分的改变。（2）青霉素：抑制细胞壁的合成，由于细胞内外的渗透压的差异使谷氨酸泄漏出来。25.2氨基酸发酵的代谢控制25.2氨基酸发酵的代谢控制3、控制旁路代谢例如：L－异亮氨酸的生物合成可由L－苏氨酸改为D－苏氨酸途径，即采用旁路代谢。25.2氨基酸发酵的代谢控制25.2氨基酸发酵的代谢控制4、降低反馈作用物的浓度控制反馈作用物浓度，克服反馈抑制和阻遏，使氨基酸的生物合成反应能够顺利进行。25.2氨基酸发酵的代谢控制25.2氨基酸发酵的代谢控制5、消除终产物的反馈抑制与阻遏作用消除终产物的反馈抑制与阻遏作用，是通过使用抗氨基酸结构类似物突变株的方法来进行。例：利用抗性突变株消除S－（β－氨基乙酸）－L－半胱氨酸（即AEC）（赖氨酸的结构类似物）与L－苏氨酸的协同抑制。25.2氨基酸发酵的代谢控制25.2氨基酸发酵的代谢控制6、促进ATP的积累，增加氨基酸的生物合成氨基酸的生物合成需要能量，ATP的积累可促进氨基酸的生物合成。25.2氨基酸发酵的代谢控制25.2氨基酸发酵的代谢控制与育种25.2.3氨基酸产生菌的定向育种代谢控制发酵：根据菌种的代谢特性，人为改变菌种的代谢调控机制，使微生物体内的的代谢流按照人们所要求的方向进行，过量积累氨基酸。代谢控制发酵的前提是选育出特定的菌种。氨基酸菌种选育的成果是代谢调控理论应用于育种实践的成功典范。选择出发菌株：前人经验；代谢途径简单、清楚；易于解除代谢控制机制。育种原理：部分或全部解除微生物对氨基酸合成代谢的自我调节机制育种方法：传统方法现代方法定向育种25.2.3.1解除反馈调节-结构类似物抗性株选育所谓结构类似物（又称代谢拮抗物）是指那些在结构上和代谢终产物（氨基酸、嘌呤、维生素等）相似的物质。如：异烟肼（“雷米封”）是吡哆醇的结构类似物，利用含异烟肼梯度平板筛选异烟肼抗性突变株，可达到定向培育吡哆醇高产突变株的目的。为什么在筛选突变株时,不能直接用代谢产物,而必须用其结构类似物?25.2.3.2切断支路代谢—营养缺陷型的选育野生型菌株经诱变剂处理后，由于发生了丧失某种酶合成能力的突变，因而只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长的突变菌株（主要指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力）。营养缺陷型切断一些相关的代谢流，消除了协同控制机制，可以过量积累特定氨基酸。利用营养缺陷型菌株生产时，营养缺陷物质的添加量一般在亚适量