猪脱碘酶3基因定位及对生产性状的潜在影响

书书书畜牧兽医学报　２０１０，４１（４）：３８３３８６犃犮狋犪犞犲狋犲狉犻狀犪狉犻犪犲狋犣狅狅狋犲犮犺狀犻犮犪犛犻狀犻犮犪猪脱碘酶３基因定位及对生产性状的潜在影响蒋晓玲，赵晓枫，郭晓令，徐宁迎（浙江大学动物科学学院，杭州３１００２９）摘　要：为确定猪脱碘酶３（ＤＩＯ３）基因能否作为某些生产性状的候选基因，本研究设计猪犇犐犗３基因特异引物，采用辐射杂种细胞系，将其定位在猪７号染色体微卫星ＳＷ７６４附近。通过比较猪ＱＴＬ数据库，发现该座位存在７个分别影响猪肌纤维直径、内脂率、胴体长、胴体质量、皮质醇水平调控的ＱＴＬ，结果表明犇犐犗３基因可作为猪肉质性状、胴体性状和应激相关性状的候选基因。关键词：猪；脱碘酶３基因；ＲＨ定位；候选基因中图分类号：Ｓ８２８；Ｓ８１３．１　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：０３６６６９６４（２０１０）０４０３８３０４收稿日期：２００９０５２７基金项目：浙江省科技厅重大项目（２００５Ｃ１２００５２）；浙江省重大科技攻关项目（２００６Ｃ００４（２））作者简介：蒋晓玲（１９８５），女，浙江乐清人，博士生，主要从事动物遗传繁育研究，Ｔｅｌ：０５７１８６９７１３０８，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]通讯作者：徐宁迎，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]犕犪狆狆犻狀犵狅犳犘狅狉犮犻狀犲犇犐犗３犌犲狀犲犪狀犱犃狀犪犾狔狊犻狊狅犳犐狋狊犘狅狋犲狀狋犻犪犾犐狀犳犾狌犲狀犮犲狅狀犘狉狅犱狌犮狋犻狅狀犜狉犪犻狋狊ＪＩＡＮＧＸｉａｏｌｉｎｇ，ＺＨＡＯＸｉａｏｆｅｎｇ，ＧＵＯＸｉａｏｌｉｎｇ，ＸＵＮｉｎｇｙｉｎｇ（犆狅犾犾犲犵犲狅犳犃狀犻犿犪犾犛犮犻犲狀犮犲，犣犺犲犼犻犪狀犵犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔，犎犪狀犵狕犺狅狌３１００２９，犆犺犻狀犪）犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｉｆｐｏｒｃｉｎｅ犇犐犗３ｇｅｎｅｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄａｓａｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｓｏｍｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｒａｉｔｓｏｆｐｏｒｃｉｎｅ，ｐｏｒｃｉｎｅ犇犐犗３ｇｅｎｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｎｄｕｓｅｄｉｎｔｈｅｒａｄｉａｔｉｏｎｈｙｂｒｉｄｍａｐｐｉｎｇ．ＴｈｅＲＨｍａｐｐｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｉｓｇｅｎｅｗａｓｎｅａｒｔｏｔｈｅｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅＳＷ７６４ｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ７．ＳｅｖｅｎＱＴＬｓｆｏｒｍｕｓｃｕｌａｒｆｉｂｅｒｄｉａｍｅｔｅｒ，ｉｎｔｅｒｎａｌｆａｔｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ，ｃａｒｃａｓｓｌｅｎｇｔｈ，ｃａｒｃａｓｓｗｅｉｇｈｔ，ａｎｄｃｏｒｔｉｓｏｌｌｅｖｅｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｅｒｅｆｏｕｎｄａｔｔｈｉｓｌｏｃｕｓｂｙｓｅａｒｃｈｉｎｇｐｉｇＱＴＬｄａｔａｂａｓｅ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｕｇｇｅｓｔｔｈａｔ犇犐犗３ｃｏｕｌｄｂｅａｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｆｏｒｐｏｒｃｉｎｅｍｅａｔｑｕａｌｉｔｙｔｒａｉｔｓ，ｃａｒｃａｓｓｔｒａｉｔｓａｎｄｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅ．犓犲狔狑狅狉犱狊：ｓｗｉｎｅ；犇犐犗３ｇｅｎｅ；ＲＨｍａｐｐｉｎｇ；ｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅ　　甲状腺为哺乳动物体内的重要内分泌腺，其分泌的甲状腺激素在动物生长分化、能量代谢调控以及几乎所有组织的生理功能中都发挥着极其重要的作用［１］。甲状腺激素的合成和分泌受到下丘脑垂体甲状腺轴调控，而在靶组织中主要由脱碘酶和甲状腺激素转运体调节。目前已知主要有３种脱碘酶，其中脱碘酶３（ｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅｄｅｉｏｄｉｎａｓｅｔｙｐｅＩＩＩ，ＤＩＯ３）是主要的Ｔ３和Ｔ４失活酶，调节着局部组织甲状腺激素水平的动态平衡［２３］。犇犐犗３编码基因无内含子，仅有一个外显子，人犇犐犗３基因全长２．１ｋｂ，编码含２７９个氨基酸的多肽链。Ｗａｓｓｅｎ等考虑以家猪作为研究人类甲状腺激素生理功能的模型，于２００４年克隆了猪３种脱碘酶的ｃＤＮＡ序列［４］，但目前未见文献报道脱碘酶基因多态及其与猪生产性状之间的关系。为筛选影响猪经济性状的候选基因，又考虑到犇犐犗３功能的重要性，本研究用辐射杂种细胞系将其进行染色体定位，并与相关遗传图谱进行整合分析［５］，评估其对猪生产性状的潜在影响，以期为确定猪犇犐犗３基因能否作为某些生产性状的候选基因，为开展进一步的研究提供参考依据。１　材料与方法１．１　引物设计根据ＧｅｎＢａｎｋ上猪犇犐犗３ｍＲＮＡ序列（Ｇｅｎ畜　牧　兽　医　学　报４１卷　Ｂａｎｋ登陆号：ＮＭ＿００１００１６２５）设计特异引物，其中上游引物Ｆ为５′ＣＧＴＣＧＧＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＡ３′，下游引物Ｒ为５′ＴＧＣＴＧＣＧＧＧＡＴＧＣＴＧＴＡＧＧＧＡＧＡＧ３′。引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。１．２　辐射杂种细胞系猪和仓鼠基因组ＤＮＡ均来自于猪仓鼠体细胞放射杂交板（ＩＭｐＲＨｐａｎｅｌ），由法国细胞遗传学实验室提供。该杂交板是用６０Ｇｙ的辐射剂量制作的１２１管猪仓鼠体细胞杂交板，其中包括１１８管猪和仓鼠细胞的杂交克隆，１管猪基因组ＤＮＡ阳性对照，１管仓鼠基因组ＤＮＡ（Ｗｇ３）和１管无任何ＤＮＡ模板的ＴＥ阴性对照。１．３　目的片段扩增以猪基因组ＤＮＡ为模板，用引物Ｆ和Ｒ进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应体系为１０μＬ，其中１０×Ｂｕｆｆｅｒ１．０μＬ，２５ｍｍｏｌ·Ｌ１ＭｇＣｌ２０．６μＬ，１０ｍｍｏｌ·Ｌ１ｄＮＴＰｓ０．２μＬ，１０μｍｏｌ·Ｌ－１引物Ｆ和Ｒ各０．８μＬ，ｒ犜犪狇１Ｕ（ＴａＫａＲａ公司），模板ＤＮＡ２５ｎｇ。ＰＣＲ扩增条件为：９４℃预变性３ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，６５℃４５ｓ，７２℃３０ｓ，３０个循环；７２℃延伸７ｍｉｎ。将扩增得到的ＰＣＲ产物送上海英骏公司（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）进行正反向测序验证。１．４　犐犕狆犚犎板犘犆犚扩增以引物Ｆ和Ｒ作为定位引物，用上述ＰＣＲ反应体系和条件扩增ＩＭｐＲＨ板中的１１８个猪仓鼠体细胞杂交系及其阳性、阴性对照。ＰＣＲ产物用１．５％琼脂糖凝胶电泳进行检测。１．５　定位将统计结果提交至ＩＭｐＲＨ服务器（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｐｒｈ．ｔｏｕｌｏｕｓｅ．ｉｎｒａ．ｆｒ）进行统计分析，得到与该基因紧密连锁的微卫星标记，获取其染色体定位信息，并借助ＲＨ图和遗传连锁图谱将犇犐犗３基因定位在猪染色体的相应位置上。２　结　果２．１　猪犇犐犗３基因扩增片段及犐犕狆犚犎板的犘犆犚扩增以猪基因组ＤＮＡ为模板，用引物Ｆ和Ｒ进行ＰＣＲ扩增，得到了长为４１３ｂｐ的片段（图１）。测序结果显示扩增片段与ＧｅｎＢａｎｋ上的序列完全一致。而以仓鼠基因组为模板进行ＰＣＲ扩增，无扩增产物，说明这对引物可用于定位猪犇犐犗３基因。用此对引物对猪仓鼠体细胞放射杂交板试剂Ｍ．ＤＮＡ相对分子质量标准；１．以仓鼠基因组ＤＮＡ为模板；２．以猪基因组ＤＮＡ为模板Ｍ．ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１．ＨａｍｓｔｅｒｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗａｓｕｓｅｄａｓＴｅｍｐｌａｔｅ；２．ＰｏｒｃｉｎｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｗａｓｕｓｅｄａｓＴｅｍｐｌａｔｅ图１　犇犐犗３基因片段犘犆犚扩增结果犉犻犵１　犘犆犚犪犿狆犾犻犳犻犮犪狋犻狅狀狉犲狊狌犾狋狊狅犳犇犐犗３犵犲狀犲盒（ＩＭｐＲＨｐａｎｅｌ）进行扩增并进行电泳检测和统计。其结果为：０００００００００１０１１００１０００００００００？１００００００１００００００００１１１０００１０００１００００００１０００００００１００００００１０００１００１１０１００００００００１０１０００１０１００１１０００１００００００１０。能扩增出ＰＣＲ产物的以“１”表示，不能扩增出ＰＣＲ产物的以“０”表示，判断不清楚的用“？”表示。２．２　猪犇犐犗３基因的犚犎定位结果将上述扩增结果递交ＩＭｐＲＨｓｅｒｖｅｒ，ｔｗｏｐｏｉｎｔ分析显示与待定位基因犇犐犗３较紧密连锁的２个微卫星标记座位为ＳＷ７６４和ＳＳＣ１２Ｂ０９，其ＬＯＤ值分别为１０．１３和８．７５。Ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ分析结果为Ｓ００２５ＳＷ１３５４Ｓ００６４ＳＷ２１５５Ｓ０１０２ＮＦＫＢＴＣＲＡＳＷＲ１８０６ＳＷ３５２Ｓ０１１５ＴＧＦＢ３ＳＷ１０８３ＳＷ５８１ＳＷ２５３７ＳＷ７６４ＳＳＣ１２Ｂ０９ＤＩＯ３ＳＳＣ２Ｂ０２。结合遗传连锁图和ＲＨ图将犇犐犗３定位在猪７号染色体ｑ臂，如图２所示。２．３　猪犇犐犗３基因定位区域的犙犜犔及其潜在功能评估　　登陆动物基因组ＱＴＬ数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｎｉｍａｌｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ＱＴＬｄｂ／ｐｉｇ．ｈｔｍｌ），查询７号染色体上的ＱＴＬ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｕｓ，数量性状基因座）标记发现，在猪犇犐犗３基因定位区域（ＳＷ７６４附近）存在多个ＱＴＬ标记（图２），其位置及相关生产性状见表１。可见犇犐犗３基因可能对猪胴体长、胴体质量、肌纤维直径、脂肪含量以及皮质４８３　４期蒋晓玲等：猪脱碘酶３基因定位及对生产性状的潜在影响左图为猪ＲＨ图谱，犇犐犗３基因与微卫星标记ＳＷ７６４紧密连锁；右图为猪７号染色体的ＱＴＬ标记图（仅示位于ＳＷ７６４附近的ＱＴＬｓ）ＬｅｆｔｐａｎｅｌｉｓｐａｒｔｏｆｔｈｅｐｏｒｃｉｎｅＲＨｍａｐ，犇犐犗３ｇｅｎｅｗａｓｌｉｎｋｅｄｗｉｔｈｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅＳＷ７６４．ＲｉｇｈｔｐａｎｅｌｓｈｏｗｓｔｈｅＱＴＬｓｌｏｃａｔｅｄｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ７（ＯｎｌｙＱＴＬｓｆｌａｎｋｉｎｇｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅＳＷ７６４ａｒｅｓｈｏｗｎ）图２　猪犇犐犗３基因定位及比较分析犉犻犵２　犕犪狆狆犻狀犵犪狀犱犮狅犿狆犪狉犪狋犻狏犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狆狅狉犮犻狀犲犇犐犗３犵犲狀犲醇水平调控有潜在影响。另外，在犇犐犗３基因的定位区域附近，还有影响摄食量（ＦｅｅｄＩｎ）、日增体质量和板油质量（ＬＦＷ）的ＱＴＬ。表１　猪犇犐犗３基因定位区域犙犜犔犜犪犫犾犲１　犙犜犔狊犪狋狋犺犲犾狅犮狌狊狅犳狆狅狉犮犻狀犲犇犐犗３犿犪狆狆犲犱ＱＴＬ标记ＱＴＬｍａｒｋｅｒ性状Ｔｒａｉｔ中心位置／ｃＭＣｅｎｔｅｒｌｏｃａｔｉｏｎ参考文献ＲｅｆｅｒｅｎｃｅＤＩＡＭＦ肌纤维直径Ｍｕｓｃｕｌａｒｆｉｂｅｒｄｉａｍｅｔｅｒ１６８［６］ＣＲＣＬ胴体长Ｃａｒｃａｓｓｌｅｎｇｔｈ１５７［７］ＩＦＰ内脂率Ｉｎｔｅｒｎａｌｆａｔｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ１５７［８］ＤＣＯＲＴ皮质醇变化Ｃｏｒｔｉｓｏｌｖａｒｉａｔｉｏｎｓ１５６［９］ＣＯＲＴ１皮质醇基础水平Ｂａｓａｌｃｏｒｔｉｓｏｌｌｅｖｅｌ１３４．９［９］ＣＯＲＴ２应激后皮质醇水平Ｐｏｓｔｓｔｒｅｓｓｃｏｒｔｉｓｏｌｌｅｖｅｌｓ１３４．９［９］ＢＷＬ线性胴体质量Ｃａｒｃａｓｓｗｅｉｇｈｔｌｉｎｅａｒ１４９．８［１０］３　讨　论本研究运用辐射杂交细胞系技术，将猪犇犐犗３基因定位在７号染色体ｑ臂上，且与２个微卫星标记的ＬＯＤ值均在５以上，表明定位结果是可信的。３种脱碘酶的表达谱具有组织特异性，对底物亲和力也不同，在Ｔ４／Ｔ３代谢中处于不同角色。脱碘酶３主要存在于脑、皮肤、胎盘、妊娠子宫以及各种胎儿和神经组织中［３］，说明ＤＩＯ３在胚胎发育过程中发挥着重要作用。ＤＩＯ３对于动物生产性状的影响可能早在幼年期，甚至胚胎发育期就已产生。本研究发现，在猪犇犐犗３基因定位区域存在７个分别与肌纤维直径、内脂率、胴体长、胴体质量、皮质醇调控相关的ＱＴＬ，同时在定位区域附近还有影响摄食量、日增体质量和板油质量的ＱＴＬ，这与ＤＩＯ３灭活的甲状腺激素具有重要而广泛的生理功能是相符的，如甲状腺激素能促进机体的物质与能量代谢，促进组织生长，影响蛋白质、脂肪、糖和水盐等的代谢，并对消化、吸收、心血管、性腺、骨骼和神经系统均有重要作用。这些均表明猪犇犐犗３基因可能对猪５８３畜　牧　兽　医　学　报４１卷　肉质性状、胴体性状、应激反应有潜在的影响，可作为影响猪这些生产性状的候选基因进行进一步研究。需特别关注的是，在小鼠研究模型中，犇犐犗３基因表现为印记基因，优先表达来源于父本的等位基因，即犇犐犗３基因多态对甲状腺激素动态平衡的影