Waters-Acquity-UPLC培训教程

©2011WatersCorporation1培训教程培训教程培训教程培训教程HHHH----ClassClassClassClass基础基础基础基础©2011WatersCorporation2ACQUITYH-Class©2011WatersCorporation3内容提要
HPLC原理回顾
UPLC基本原理
HPLC与UPLC的异同
H-Class基本原理
小结©2011WatersCorporation4什么是HPLC?
高效液相色谱法，HPLC(HighPerformanceLiquidChromatography)是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段：—高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器……
广泛应用于各个领域：—医药，环保，石化，生命科学，食品工业，农业……
无论在技术上、理论上，还是在应用上仍有较大的发展空间©2011WatersCorporation5色谱分离原理分离是一个分离是一个分离是一个分离是一个物理过程物理过程物理过程物理过程。固定相固定相固定相固定相(StationaryPhase)流动相流动相流动相流动相(MobilePhase)进样进样进样进样(Injection)洗脱洗脱洗脱洗脱(Elution)相互作用相互作用相互作用相互作用(Interaction)©2011WatersCorporation6HPLC的图形结果色谱图(Chromatogram)：色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为时间←←←←色谱峰色谱峰色谱峰色谱峰时间时间时间时间(分分分分)基线基线基线基线↓↓↓↓峰高峰高峰高峰高峰宽峰宽峰宽峰宽响应值响应值响应值响应值©2011WatersCorporation7分离度方程式(((())))κκκκ′′′′++++κκκκ′′′′αααα−−−−αααα====1N141R分离因子分离因子分离因子分离因子柱效柱效柱效柱效保留因子保留因子保留因子保留因子
分离度方程式描述了分离度与分离因子，柱效和保留因子之间的关系
它是评价一张色谱图以及决定如何解决、开发和优化分离方法的依据©2011WatersCorporation8保留因子(K′):保留能力的量度3.5.5-2k'2=====0V0V1Vk'1−=:公式1.5.5-1k'1==9.5.5-5k'3==V0V1V2V3时间时间时间时间.5125k′′′′是样品与填料作用强度的直接量度是样品与填料作用强度的直接量度是样品与填料作用强度的直接量度是样品与填料作用强度的直接量度©2011WatersCorporation9分离因子(α):峰分离程度的量度0V1V0V2V1k'2k'−−=αααα====αααα或3.5-1.5-2==αααα12/的峰峰9.5-1.5-5==13/αααα的峰峰V0V1V2V3时间时间时间时间.5125α是两个化合物在同一套色谱系统上保留差异的数值表述©2011WatersCorporation10理论塔板数(N):分离效率的量度1600N.5516NWV16N22============100N2516NWV16N22============PW=.5PW=2理论塔板数或柱效是一个数值理论塔板数或柱效是一个数值理论塔板数或柱效是一个数值理论塔板数或柱效是一个数值,,,,它表示作为保留时间函数的峰展宽的它表示作为保留时间函数的峰展宽的它表示作为保留时间函数的峰展宽的它表示作为保留时间函数的峰展宽的量度量度量度量度©2011WatersCorporation11关于柱效或塔板数
塔板数是综合反映色谱柱和仪器性能的关键指标
取决于下列两个参数:—保留时间—峰宽
窄峰
高塔板数
峰形越均匀
塔板数越高
分析型HPLC典型的塔板数值(5σ)约为100,000/米
UPLC典型的塔板数值(5σ)高达200,000/米©2011WatersCorporation12塔板数值
塔板数值受下列因素影响：—机械因素o仪器o联接(端口接头,锥箍)o柱装填的好坏—化学因素o色谱因素(溶剂)o填料的生产制造质量©2011WatersCorporation13HPLC实验的基本类型
等度等度等度等度—ISO



相同的相同的相同的相同的—在整个在整个在整个在整个运运运运行行行行过过过过程中溶程中溶程中溶程中溶剂组剂组剂组剂组成保持不成保持不成保持不成保持不变变变变—(60:40甲醇甲醇甲醇甲醇/水水水水)©2011WatersCorporation14HPLC实验的基本类型
梯度梯度梯度梯度—在在在在运运运运行行行行过过过过程中溶程中溶程中溶程中溶剂组剂组剂组剂组成或流速成或流速成或流速成或流速变变变变化化化化—渐变渐变渐变渐变或台或台或台或台阶阶阶阶式式式式变变变变化化化化•100%H20/0%MeOH到到到到0%H2O/100%MeOH©2011WatersCorporation15梯度曲线轮廓图用于用于用于用于WatersHPLC系统系统系统系统%B时间时间时间时间瞬间瞬间瞬间瞬间凸线凸线凸线凸线凹线凹线凹线凹线线性线性线性线性©2011WatersCorporation16筛板筛板筛板筛板球形颗粒球形颗粒球形颗粒球形颗粒无定形颗粒无定形颗粒无定形颗粒无定形颗粒填充床填充床填充床填充床(固定相固定相固定相固定相)色谱柱的装填填充色谱柱的填充色谱柱的填充色谱柱的填充色谱柱的流动方向流动方向流动方向流动方向©2011WatersCorporation17颗粒度分布
具名具名具名具名义值义值义值义值的填料有一个的填料有一个的填料有一个的填料有一个颗颗颗颗粒度分布的范粒度分布的范粒度分布的范粒度分布的范围围围围—例如例如例如例如:4μμμμm(2–10μμμμm)
窄的分布会窄的分布会窄的分布会窄的分布会给给给给出出出出较较较较高的性能高的性能高的性能高的性能357456微米微米微米微米©2011WatersCorporation18用于HPLC色谱柱的典型填料
硅硅硅硅胶胶胶胶—二二二二氧氧氧氧化硅化硅化硅化硅—无无无无规则规则规则规则或球形或球形或球形或球形
铝铝铝铝—氧氧氧氧化化化化铝铝铝铝—无无无无规则规则规则规则或球形或球形或球形或球形
聚合物聚合物聚合物聚合物—聚聚聚聚苯苯苯苯乙乙乙乙烯烯烯烯二乙二乙二乙二乙烯烯烯烯基基基基苯苯苯苯—球形球形球形球形
杂杂杂杂化化化化—硅硅硅硅胶胶胶胶和聚合物的和聚合物的和聚合物的和聚合物的结结结结合合合合—球形球形球形球形©2011WatersCorporation19广泛用于HPLC的柱填料
C18—也叫作ODS或RP18oOctaDecylSilane—超过全部应用的70%—反相键合在硅胶基质上—“Waxed(上蜡的)”硅胶颗粒—非极性的©2011WatersCorporation20HPLCC18柱有各种不同品牌
一个独立的生产厂商能制造出许多不同品牌的C18柱—XBridge，SunFire，Atlantis，……
每一个品牌被设计成达到不同的色谱目的—高效能—没有拖尾—独特的选择性—高疏水性—高硅醇基活性©2011WatersCorporation21反相色谱柱选择性图表Retentivity(ln[k]acenaphthene)SunFire™C18YMC-Pack™PolymerC18™Hypersil®CPSCyanoYMC-Pack™CNWatersSpherisorb®S5PHypersil®BDSPhenylNova-Pak®PhenylYMC-Pack™PhenylHypersil®PhenylInertsil®Ph-3YMC-Pack™ProC4™YMCbasic™Symmetry®C8YMC-Pack™ProC8™Nova-Pak®C8XTerra®MSC18Symmetry®C18YMC-Pack™ProC18™Inertsil®ODS-3YMC-Pack™ODS-A™Nova-Pak®C18YMCJ'sphere™ODS–L80Nucleosil®C18WatersSpherisorb®ODS2WatersSpherisorb®ODS1Resolve®C18µBondapak™C18YMC-Pack™ODS–AQ™YMCJ'sphere™ODS–H80YMCJ'sphere™ODS–M80Inertsil®CN-3WatersSpherisorb®S5CNNova-Pak®CNHPSymmetryShield™RP8SymmetryShield™RP18XTerra®RP8XTerra®RP18-0.6-0.300.30.60.91.21.51.82.12.42.733.33.6-1.5-0.50.51.52.53.5Selectivity(ln[αααα]amitriptyline/acenaphthene)XTerra®MSC8Luna®C18(2)ACQUITYUPLC™BEHXBridge™C18XTerra®PhenylLuna™PhenylHexylChromolith™RP-18Atlantis®dC18Zorbax®XDBC18ACTAce®C18Zorbax®SBC18SunFire™C8Luna®C8(2)ACQUITYUPLC™BEHXBridge™ShieldRP18ACQUITYUPLC™BEHXBridge™C8ACQUITYUPLC™BEHXBridge™Phenyl杂化填料技术杂化填料技术杂化填料技术杂化填料技术©2011WatersCorporation22色谱柱几何概况
直径—较小的直径增加灵敏度—较大的直径增加柱容量
长度—较长的柱子具有较高的分离能力和柱容量—较短的柱子具有较快的分离速度和较低的柱容量©2011WatersCorporation23如何得到尖锐的色谱峰色谱图上被分析物的峰色谱图上被分析物的峰色谱图上被分析物的峰色谱图上被分析物的峰柱内被分析物的谱带柱内被分析物的谱带柱内被分析物的谱带柱内被分析物的谱带©2011WatersCorporation24色谱柱接头ACQUITYUPLC0.080–0.090″″″″Parker/Swagelok制式制式制式制式其它其它其它其它Waters®色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱0.120–0.130″″″″Waters制式制式制式制式©2011WatersCorporation25柱外谱带扩展额外的谱带额外的谱带额外的谱带额外的谱带扩展体积扩展体积扩展体积扩展体积©2011WatersCorporation260.0090.0050.020过长的管路也会造成谱带展宽过长的管路也会造成谱带展宽过长的管路也会造成谱带展宽过长的管路也会造成谱带展宽较尖锐的峰得到较较尖锐的峰得到较较尖锐的峰得到较较尖锐的峰得到较好的分离度和检测好的分离度和检测好的分离度和检测好的分离度和检测灵敏度灵敏度灵敏度灵敏度被分析物的量都一样被分析物的量都一样被分析物的量都一样被分析物的量都一样,因此峰面积也一因此峰面积也一因此峰面积也一因此峰面积也一样样样样,但是峰高却不相同但是峰高却不相同但是峰高却不相同但是峰高却不相同样品在管路内的谱带扩展©2011WatersCorporation27UPLC理论和原理
UltraPerformanceLC—分离科学的一个新进展
UPLC使用与HPLC同样的理论和原理
基于更细的(1.7µm)颗粒化学—更快的分析速度—增加灵敏度—增大组份分离度—增高系统反压©2011WatersCorporation28UltraPerformanceLC™AcquityAcquityAcquit