大肠杆菌基因工程

基因工程GeneticEngineering主讲教师：李黄金:[e-mail]任课教师：张文峰、陈伟生命科学与生物制药学院２０13第三章大肠杆菌基因工程Escherichiacoli（SEM，×14000）四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化三、工程菌构建策略二、大肠杆菌表达系统高效表达原理一、大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例第三章大肠杆菌基因工程工程菌构建发酵工艺研究分离纯化工艺研究四、工程菌构建、发酵与产物分离纯化工程菌构建研究内容与技术路线目的蛋白分析表达载体与宿主菌株选择目的基因的获得与优化表达载体构建与分析转化与表达筛选工程菌稳定性分析表达产物确证工程菌菌种保存1、目的蛋白分析：糖基化？难表达？难复性？药用？1)理化特性()*分子大小：≤5KD、≥100KD难表达（融合表达、截短表达）*氨基酸组成：Cys、Pro多的难表达（用真核系统）*疏水性：疏水性强的难表达（截短表达、用真核系统）2)生物学特性：膜蛋白难表达（截短表达、用真核系统）工程菌构建主要研究内容3)用途药用：安全性、产量、成本（包涵体、独立表达）工业用：产量、成本（包涵体、独立表达）研究用：迅速获得活性产品为首要考虑（可溶、融合表达）工程菌构建主要研究内容2、选择表达载体与宿主菌株：1）表达载体选择启动子、标签、标记基因、拷贝数等。需要可溶表达时采用弱启动子，T7启动子最强，PL/PR热激诱导不宜工业化。从蛋白特性、用途、发酵和分离纯化工艺考虑标签。药用避免氨苄青霉素，用卡拉霉素。4）宿主菌：符合表达要求（T7RNA酶溶源？可溶？稀有密码tRNA？），来源与遗传背景清楚，资料翔实。工程菌构建主要研究内容3、目的基因获得、分析与优化克隆、合成、索要？工程菌构建主要研究内容翻译起始位点与终止密码子：头尾不要缺，中间不能断GC含量：＞70%时表达水平低二级结构：mRNA二级结构抑制翻译的起始或终止。基因或者蛋白的大小：一般说来小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。前者融合表达，后者截取表达（如抗原用途，选抗原性强、好表达区段）。疏水性：疏水性强的、特别是膜蛋白难表达。截取表达。N端和C端稳定性：人为突变末端残基。4、表达载体构建与分析1）根据选定载体物理图和基因特点设计与构建PCR扩增目的基因：*引物中引入适当的酶切位点，避免基因内部位点。*是否需要目的基因带入ATG和TAA？是否要对框？2）表达载体酶切分析：双酶切、多酶切图谱分析3）目的基因序列分析：目的基因或表达盒序列分析工程菌构建主要研究内容pET21a质粒物理图谱pET21a质粒多克隆位点与表达盒pET32a质粒物理图谱pET32a质粒多克隆位点与表达盒M1234目的基因：VL-Δω,表达载体：pET32aM：Maker，1kblader1：PCR产物，引物含NcoI、HindIII2：HindIII单酶切pET32a质粒3：NcoI-HindIII双酶切重组子4：HindIII单酶切重组子pET32a-VL-Δω酶切鉴定5、转化与表达筛选1）转化选定的工程菌宿主株（不同于克隆宿主菌！）2）表达筛选：以表达水平（%）为指标。表达水平（%）=目的产物占总蛋白的百分数测定方法：SDS-PAGE+凝胶扫描分析工程菌构建主要研究内容6、表达产物确证1）基本要求：SDS-PAGE+Western-Blot2）特殊要求（如基因工程药物）：A、结构：末端顺序（N-端15个/C端3个）、氨基酸组成、肽图等B、理化特性：分子量（SDS-PAGE、质谱）、等电点、紫外特征吸收峰等C、生物学活性工程菌构建主要内容基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制改善工程菌不稳定性的策略大肠杆菌工程菌的不稳定性工程菌遗传稳定性分析7、工程菌遗传稳定性分析工程菌遗传不稳定性的表现形式结构不稳定性重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失（不表达、产物结构改变）分配不稳定性（主要）整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing）。导致表达水平下降。重组质粒的逃逸：工程菌部分细胞因质粒丢失而不再携带重组质粒的现象。重组质粒的宏观逃逸率：工程菌培养液中丢失质粒的细胞占细胞总数的百分比。宏观逃逸率（%）=非选择性平板菌落数-选择性平板菌落数非选择性平板菌落数×100关闭质粒DNA合成途径，启动降解程序重组质粒逃逸的原因环境因素诱导的重组质粒渗漏高温、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料（吖啶）目的基因高效表达诱导宿主细胞产生应激反应目的基因表达盒“转录过头”，影响Ori区域。目的基因本底表达产物引起的毒性反应抗性标记基因过表达，抗生素消耗过快。重组质粒结构不稳定性的产生原因宿主细胞中的修饰性酶系对外源重组DNA分子的破坏环境因素诱导的突变宿主细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排改善基因工程菌不稳定性的策略1、改进载体-宿主系统选择性地杀死无质粒细胞如敲除宿主基因组致死性基因（如ssb基因，缺失无法DNA复制），并将其改由表达载体提供正确设置载体上的多克隆位点，避免DNA片段插在稳定区内选择特定质粒最适宿主菌株使用可控型复制子（扩增与表达诱导同步)改善基因工程菌不稳定性的策略2、施加选择压力根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素药物和食品生产时不宜使用抗生素采用营养缺陷型宿主菌，载体含营养标记，培养基不含该营养组份改善基因工程菌不稳定性的策略3、采用严紧调控型载体系统，减少本底表达造成的不稳定4、优化工程菌的培养工艺培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定培养温度：较低的培养温度有利于重组质粒的稳定在非选择条件下连续传代数代后，对工程菌重组质粒存在状况、结构完整性和功能完整性进行分析：A、存在状况：宏观逃逸率B、结构完整性：酶切图谱分析、序列分析C、功能完整性：表达产物免疫特异性（westernblotting)表达水平（%）工程菌遗传稳定性分析1、原始菌种保存：实验室构建而来。冻干、-70℃保存。表达载体（质粒）和宿主菌分别冻存更稳定。2、主细胞库（mastercellbank,MCB）：由原始菌种单一克隆一次培养与分装而来，供工作细胞库制备。冻干、-70℃保存。3、工作细胞库（workingcellbank,WCB）:由主细胞库单个最小包装甘油种培养与分装而来，供生产用。甘油种，-70℃保存。8、工程菌菌种保存（三级种子库）工程菌生长与表达主要影响因素工程菌摇瓶水平生长与表达试验工程菌工业发酵工艺研究工程菌发酵工艺研究1、培养基2、菌龄与接种量3、pH值、温度与溶解氧4、诱导时机与收菌时机工程菌生长与表达主要影响因素工程菌生长曲线与表达曲线分析生长曲线纵坐标：生物量（细胞密度OD600、干重/体积、湿重/体积）横坐标：培养时间（小时）时期：停滞期、加速期、对数期、减速期、平台期、衰减期表达曲线纵坐标：表达水平（%）、活性单位/体积横坐标：培养时间（小时）1、培养基影响菌体生长、质粒稳定性、表达水平、产物可溶性等碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等应避免外源基因表达的“葡萄糖效应”。氮源：有机氮：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆无机氮：氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等其他：无机盐、微量元素维生素、生物素等工程菌生长与表达主要影响因素2、菌龄与接种量菌龄：自接种起培养的时间（小时）影响停滞期、质粒宏观逃逸率接种量：是指接入的种子液体积占培养液体积的百分比接种量过小：延长菌体停滞期，质粒宏观逃逸率高接种量过大：菌体生长过快，代谢产物积累过多，抑制后期菌体的生长，降低表达水平。3、pH值、温度与溶解氧pH值：影响生长速度、表达水平和产物可溶性。生长最适pH范围在6.8-7.4，表达最适pH为6.0-6.5温度：影响生长速度、表达水平和产物可溶性。生长最适37℃，较低温度利于可溶性表达。溶解氧：影响生长速度和表达水平4、诱导时机与收菌时机诱导时机：过早影响生物量、过晚影响表达水平一般在生长曲线对数中期或对数后期进行诱导收菌时机：过早影响表达水平、过晚影响产物稳定性、可溶性、并造成浪费。一般在表达曲线平台期（诱导后3-4小时）收菌主要研究参数：培养基、接种量、pH值、温度、诱导与收菌时机等主要观察指标表达水平（%）、生物量、表达产物积累（包涵体形成）情况、质粒宏观逃逸率等结果：生长曲线与表达曲线工程菌摇瓶水平生长与表达试验基本要求：高表达、高生物量、便于放大、低成本重点问题：1）质粒稳定性问题2）表达与生长的矛盾问题3）发酵方式问题：分批式or流加式发酵？常规发酵or高密度发酵？工程菌发酵工艺基本要求与重点问题：工程菌工业发酵工艺研究工程菌工业发酵工艺流程甘油种活化试管/摇瓶放大/种子罐发酵/发酵罐工程菌发酵工艺流程1、菌种活化：参数：培养基、温度、培养时间（菌龄）指标：菌体浓度（OD600）、质粒宏观逃逸率2、放大培养（种子液制备）：参数：菌龄、接种量、培养基、温度、溶氧、搅拌速度、转接时机（菌龄）、放大级数指标：菌体浓度（OD600）、质粒宏观逃逸率结果：生长曲线工程菌发酵工艺研究主要内容3、发酵（放大培养与表达）：参数：种子液菌龄、接种量、培养基、温度、溶氧、搅拌速度、诱导时机、收菌时机指标：菌体浓度、表达水平、质粒宏观逃逸率结果：生长曲线、表达曲线工程菌发酵工艺研究主要内容4、发酵方式：1）批式发酵：较常用，高表达、但菌体量较少。2）流加发酵：较常用，主要补充碳源，菌体量大、表达水平下降，碳源流加时机和速度是关键。*高密度发酵：无机盐介质，通过碳源限制和流加实现高密度发酵。3）连续发酵：少用，高表达、高总生物量、难控制。工程菌发酵工艺研究主要内容基因工程发酵表达产物分离纯化工艺研究分离纯化工艺研究的目的、任务和要求分离纯化工艺设计原则粗提工艺精纯工艺*精纯主要任务*分离纯化总策略*色谱技术为基础的精纯工艺分离纯化工艺研究的目的、任务和要求目的：建立高效、便于规模放大和质控的表达产物分离纯化工艺任务：1、建立粗提工艺：从菌体或培养液中获取目的产物，包涵体形式表达的尚包括变性和复性处理。2、建立精纯工艺：去除蛋白质和非蛋白质类杂质，使纯度达到指定要求。3、建立工艺过程质控体系要求：高活性、高得率、高纯度、低费用表达产物分离纯化原则要建立一个方便灵敏的蛋白检测方法，以估价每一步的提纯程度；分离步骤要尽可能少，每一步便于工业放大；尽量采用柱层析技术，各步骤间样品应无需复杂处理；初步分离要快速、大规模，精纯要高分辨率；尽可能避免带入有害物质;每步需统计：得率、纯度、纯化倍数粗提离心发酵液发酵液菌体包涵体裂解液复性液菌体粗提液上清破菌、离心洗涤、裂解复性胞内表达分泌表达工艺流程精纯工艺主要任务1、去除非蛋白质类大分子杂质：内毒素、DNA、RNA、脂类、多糖等2、去除蛋白质类杂质：宿主蛋白、融合表达的Tag、质粒上其它元件表达产物、培养基带来的蛋白等。3、去除纯化方法带来的杂质分离纯化策略分离纯化三步策略分离纯化工艺设计考虑要素离子交换（Ionexchangechromatography，IEC)速度快，分辩率较高，适合前1-2步；疏水层析（Hydrophobicinteractionchromatography,HIC)速度快，分辩率较高，适合前1-2步；凝胶过滤(Gelfilter,GF)分辩率高，上样体积和洗脱速度受限制,适合最后亲和层析(Affinitychromatography,AC)速度快，分辩率较高，但成本高，配基污染，适合1-3步反相色谱（Reversedphasechromatography，RPC)分辩率高，但不适合蛋白质主要色谱技术特点色谱技术为基础的精纯工艺11Strategy/AC/1998/JB/Å.DanielssonThreePhaseStrategy-RankingofChromatographyTechn