Coombs试验

抗人球蛋白试验（Coombs试验）•Coombs试验是利用抗球蛋白抗体作为第二抗体，连接与红细胞表面抗原结合的特异抗体，使红细胞凝集。•抗人球法是检测不完全抗体的经典方法，其方法有两类。•直接Coombs试验：是检查被检红细胞上有无不完全抗体。•间接Coombs试验：是检查血清中游离的不完全抗体天然抗体与免疫血型抗体比较天然抗体免疫血型抗体性质完全抗体不完全抗体IgIgMIgG抗原刺激没有可察觉的抗原刺激经抗原刺激后才产生免疫发生的时间早期晚期分子量90万15万分子长度950250沉淀系数19S7S电泳分析IgM球蛋白IgG球蛋白对HDN的意义＊小大通过胎盘能力＊不能能反应温度＊4℃比37℃强（冷抗体）37℃（温抗体）对血型物质＊能被血型物质中和不被中和IgM抗体•免疫球蛋白中8%-10%是由IgM组成•IgM抗体分子量大，约为90万，有十个抗原结合位点，可直接致敏和凝集红细胞，•它的平均寿命为10天，•IgM抗原抗体反应中常激活补体，从而引起溶血反应。IgM抗体在盐水介质中凝集红细胞示意图IgG抗体•IgG是体液免疫应答产生的主要抗体，在血清中含量最高。约占免疫球蛋白的75%。•IgG是唯一的能通过胎盘进入胎儿体内的免疫球蛋白，同种IgG血型抗体通过胎盘，可引起新生儿溶血病。•最常见的是ABO与Rh血型系统。IgG凝集红细胞示意图IgG在盐水介质中一般不产生凝集抗球蛋白试验抗球蛋白试剂及器材1、多特异性抗球蛋白试剂（lgG、C3d）；2、柱凝集抗人球卡；3、阳性对照细胞（取3份正常人O型Rh（D）阳性红细胞等量混匀，经生理盐水洗涤后取少量压积红细胞，加抗D血清，置37℃水浴致敏1小时，取出后用生理盐水洗涤3次，配成5%红细胞悬液）；4、阴性对照细胞（取3份正常人O型红细胞等量混匀，经生理盐水洗涤后，配成5%红细胞悬液；或直接取Rh（D）阴性红细胞）；5、受检者5%（1%）红细胞悬液；6、0.9%生理盐水；7、柱凝集卡式配血系统8、滴管（加样枪）、蜡笔或记号笔、试管、显微镜、37℃水浴箱、细胞洗涤离心机等。直接抗球蛋白试验（DAT）原理•患者体内若有与红细胞抗原不相合的不完全抗体存在，可与红细胞结合形成抗原抗体复合物。•但因不完全抗体分子量小，不能有效地连接抗原抗体复合物，仅使红细胞处于致敏状态。•加入抗球蛋白血清，与红细胞上吸咐的不完全抗体结合，在致敏红细胞之间搭桥，出现肉眼可见的凝集。•这种直接检测体内被抗体或（和）补体致敏红细胞的试验称之为直接抗球蛋白试验。直接Coombs试验抗人球蛋白自身抗体致敏RBC可见凝集手工法操作1、取患者抗凝全血适量于试管中，加生理盐水洗涤3次，最后一次洗涤离心后，弃上清液，用生理盐水配成5%红细胞悬液；2、取3支试管，作好标记（患者、阳性、阴性）；3、取患者5%红悬液1滴于试管中，加生理盐水洗涤一次；尽可能弃净上清液；4、在阳、阴性试管中分别加入阳性和阴性对照红悬液1滴；5、在各管中滴加多特异性抗球蛋白试剂1滴，混匀；6、同时以1000r/min离心1分钟，轻轻摇动，先用肉眼观察管底红细胞的凝集，再用低倍镜观察柱凝集卡式法操作1、取出柱凝集Coombs卡、室温平衡并做好标记（患者、阳性、阴性）。2、分别加入1%被检红悬、阳性红悬、阴性红悬各50ul。3、不孵育，将卡放入专用离心机离心。4、取出凝集Coombs卡，观察试验结果。DAT操作表反应物检测管阳性对照阴性对照被检红细胞悬液1滴阳性红细胞悬液1滴阴性红细胞悬液1滴抗人球蛋白试剂1滴1滴1滴微柱卡Coombs试验RBC可免洗涤•因为RBC的密度远大于血清中的球蛋白，当离心时，RBC的沉降速率远大于球蛋白，故RBC首先和凝胶中的抗人球蛋白反应，而不受血清中的球蛋白干扰，从而可免除洗涤这一步骤。结果判断•先观察阴性和阳性对照管，阴性对照管无凝集，阳性对照管出现+++—++++凝集，说明检测管结果可信。•被检测管凝集，直接抗球蛋白试验阳性，不凝集者为阴性。如果实验结果为阴性，要加阳性细胞检测，结果为阳性，说明该阴性结果可靠。柱凝集判断标准间接Coombs试验（IAT）原理•用已知抗原的红细胞检测受检者血清中相应的不完全抗体；或用已知的不完全抗体检测红细胞上相应的抗原。•在37℃条件下，若被检血清或红细胞有对应的不完全抗体或抗原，则抗原抗体作用使红细胞致敏•再加抗人球蛋白试剂，与红细胞上不完全抗体结合，出现肉眼可见凝集。•这种通过体外将红细胞致敏后，再检测红细胞有无不完全抗体或抗原的试验称为间接抗人球蛋白试验。间接Coombs试验抗人免疫球蛋白同种异型抗体手工法操作•取被检血清200ul于试管中，加入等量5%已知抗原红悬液（或被检5%红悬液加入等量已知抗体血清），置37℃水浴1小时。如血清与红细胞存在相应特异性抗原抗体，则会使红细胞致敏。•取出试管，用生理盐水洗涤后，参照直接Coombs试验方法操作。•实验结果为阳性，说明受检者血清中有与已知红细胞抗原相对应的不完全抗体（或被检者红细胞上有与已知抗体相对应的抗原柱凝集卡式法操作1、取出柱凝集Coombs卡、室温平衡并做好标记（患者、阳性、阴性）。2、在患者孔中加入被检血清和1%已知抗原红悬液各50ul（或加入已知抗体血清和1%待检抗原红悬液各50ul）3、在阳性、阴性孔中加入相应1%红悬液50ul4、同时放入专用孵育器孵育5、取出用专用离心机离心。6、实验结果同手工法Coombs’试验临床意义•正常人Coombs试验直接与间接试验均为阴性•本试验是诊断自身免疫性溶血性贫血(AIHA)的重要依据，特别是IgG型引起的溶血性贫血，直接反应常呈强阳性，间接反应大多阴性，但亦可阳性•新生儿同种免疫溶血病：因Rh血型不合所致溶血病，直接及间接反应均强阳性，持续数周、换血输血后数天内可变为阴性，由于“ABO”血型不合引起的溶血病，直接常为阴性或弱阳性，间接反应为阳性•药物诱发的免疫性溶血性贫血①α-甲基多巴型：直接及间接反应均阳性。②青霉素型：直接反应阳性，间接反应阴性③福阿亭型：（奎宁等药物）抗体通常为IgM，偶有IgG型者，直接反应为阳性，间接反应阴性•冷凝集素综合征：直接反应阳性，间接反应阴性（37℃）。由于本病红细胞膜附着的是补体C4和C3而不是IgG或IgM，如果用抗IgG或抗IgM抗血清做试验时则结果阴性，如以抗补体的抗血清做试验则直接反应阳性。•红细胞血型不合引起的输血反应•ABO或Rh血型不合输血，供者的红细胞被受者的血型抗体致敏，在供者被致敏的红细胞完全破坏以前，直接反应阳性•Rh阴性者如过去不曾接受过Rh阳性者的血或曾没有妊娠Rh阳性胎儿者，间接反应阳性，第一次输血后（Rh阳性的血），数天之内间接反应也会变为阳性其它：•在传染性单核细胞增多症、SLE、恶性淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、癌肿、铅中毒、结节性动脉周围炎、EVan氏综合征等，病人直接反应亦可阳性•阵发性寒冷性血红蛋白尿症患者中，急性发作后用抗补体血清做试验直接反应常为阳性。注意事项•标本采取后应立即进行试验，延迟试验或中途停止可使抗体从细胞中丢失。•抗球蛋白试剂应按说明书最适稀释度使用，否则可产生带现象而误认结果。•本试验必须设阳性对照、阴性对照。如阳性对照管不凝集，说明抗D血清失效或抗人球蛋白血清失效，应更换血清，重作试验；若阴性对照出现凝集，可能由于抗人球蛋白血清中含有残余种属抗体，或被细菌污染；本实验均失去意义，不能判断结果。•如血清与相应红细胞在37℃水浴中致敏1小时，则血清中75%的抗体吸附于红细胞上，如致敏2小时，则抗体吸附达95%，如以低离子溶液代替生理盐水配制5%红细胞悬液，则致敏时间可减少至15～30分钟•红细胞洗涤应迅速，彻底、不应中途停止。受检红细胞一定要用盐水洗涤3次以上，洗涤时盐水要足量并用力冲入管底，使压积于管底的红细胞松离，以除去红细胞悬液中混杂的血清蛋白，要防止手上的蛋白污染。1滴1：4000稀释的血清可中和抗球蛋白血清1滴，导致假阴性结果。•全凝集或冷凝集血液标本及含有Wharton胶的脐血标本，若洗涤不充分，血液标本中有很多网织红细胞，且抗球蛋白试剂中含有抗运铁蛋白时，均可使红细胞发生凝集•如结果为阴性，最好对阴性结果进行核实，即在该试管中再加一滴lgG致敏红细胞，如结果为阳性，则表示试管内的抗球蛋白试剂未被消耗，阴性结果可靠。