PCR技术及其应用

申红基础医学教研室聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR无细胞的分子克隆法)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍.PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。基因组DNA获取特定DNA片段扩增特定DNA片段生物样品DNA片段基因诊断基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究……PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发展都使克隆基因没有成为现实，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明•1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）。•基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制。•最初采用E-coliDNA聚合酶I的Klenow片段进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错。PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明•1988年Saiki等从水生嗜热杆菌(Thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶，命名为TaqDNA聚合酶•TaqDNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪，使PCR技术得到了广泛应用•1993年，Mullis因此项技术获诺贝尔化学奖PCR的基本原理•PCR过程•PCR反应条件•PCR的特点模拟DNA的体内复制过程,即利用DNA聚合酶在体外条件下，催化一对引物间的特异DNA片段合成。PCR技术基本原理:类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：加热至93℃左右后，成为单链，与引物结合，作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物,在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环,变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理•PCR过程•PCR反应条件•PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1-3步25-30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍①变性（denaturation）在高温条件下（90~95℃），双链模板DNA的氢键断裂，解链成两条单链DNA，提供复制的模板。变性温度与时间：•变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因•一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性–若低于93℃则需延长时间–但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。模板DNA94℃②退火（annealing）在低温条件下（40~65℃），使加入的引物与单链DNA模板上待扩增DNA区域的两个侧翼准确地配对结合，并提供DNA复制起始的3′-OH。退火(复性)温度与时间：•退火温度是影响PCR特异性的重要因素•退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度•对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作为选择最适退火温度的起点较为理想PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，而且引物的分子数远远多于模板DNA，故引物与模板DNA结合的机率远远高于DNA分子自身的复性。③延伸（extension）DNA聚合酶在适当温度（70～75℃）下，以dNTP为原料，从特异结合到DNA模板上的引物3′-OH端开始，根据碱基互补配对和半保留复制原则，进行DNA链的延伸，合成与模板互补的新的DNA分子。大肠杆菌体内各聚合酶作用DNA聚合酶Ⅲ无5’→3外切酶活性切除引物,是复制时的主要聚合酶；DNA聚合酶I:主要负责除去引物并利用脱氧核苷酸填满空隙；1.5’→3’聚合酶活性。2.5’→3外切酶活性切除引物。3.3’→5’外切酶活性起校对作用DNA聚合酶Ⅱ有1和3的作用，其他作用尚不清楚。DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ涉及DNA错误修复。延伸温度与时间：•TaqDNA聚合酶的生物学活性：70～80℃150核苷酸/S/酶分子70℃60核苷酸/S/酶分子55℃24核苷酸/S/酶分子延伸温度与时间：•延伸温度：一般选择在70～75℃之间–常用温度为72℃–过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。•延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定–1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够）–3～4kb的靶序列需3～4min–扩增10Kb需延伸至15min•延伸时间过长会导致非特异性扩增•对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点70℃引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点72℃第1轮结束94℃第2轮开始PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点94℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR产物的积累规律–DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。–反应初期，目的DNA片段呈指数形式（2n）增加，随着目的DNA片段的积累，在引物—模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期—平台期，这种效应称平台效应。（25-30个循环）PCR的基本原理•PCR过程•PCR反应条件•PCR的特点标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10ulMg2+1.5mmol/L4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5u加双或三蒸水至100ulPCR操作程序①向一微量离心管中依次加入缓冲液、Mg2+、dNTP、引物、DNA模板、TaqDNA聚合酶然后用双蒸水加到最佳体系。混匀后，离心数秒，使反应成分集于管底。②加矿物油50～100μl于反应液表面（防蒸发）,置反应管于PCR仪上，设置程序，进行热循环。部分基因组DNAFig1.1GenomicDNAextractedfrombloodofpartsheep296bpMDRB1基因外显子PCR结果检测的电泳图③琼脂糖凝胶电泳（1-2%）检测扩增酶切产物。1.DNA片段长度(核苷酸数)琼脂糖凝胶电泳的核苷酸数与凝胶的范围。DNA片段长度的检测（0.8%）PCR扩增产物检测（1.5%）。酶切片段检测（2-3.5%）。2.DNA片段长度(核苷酸数)丙烯酰胺1Kb～700bp3.5(%)700b～500b5(%)500b～200b8(%)200b12(%)PCR反应五要素•引物（primer）•酶（TaqDNApolymerase）•dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）•模板（template）•Mg2+（magnesium）1、引物•引物是PCR特异性反应的关键•PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度•理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。引物设计的原则①引物长度：15-30bp，常用20bp左右—引物的有效长度不能大于38bp，否则最适延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度（74℃），不能保证PCR扩增产物的特异性。②引物扩增跨度：以500bp为宜—特定条件下可扩增长至10kb的片段③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜—G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带—ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因为这样会使引物在G+C富集区引发错误延伸④避免引物内部出现二级结构和引物间互补—特别避免3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带⑤引物3’端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰）—特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败⑥引物5′端可修饰—引物5′端限定着PCR产物的长度，但对扩增特异性影响不大；引物5′端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态；引物5′端最多可加10个碱基而对PCR反应无影响⑦引物的特异性：—引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性⑧引物量：—每条引物的浓度0.1~0.5umol或10~100pmol以最低引物量产生所需要的结果为好—引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会2、酶及其浓度•目前有两种TaqDNA聚合酶供应–天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯–基因工程酶：大肠菌合成•一个典型的PCR反应约需酶量1-2.5U/100ul体系•浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少DNA聚合酶Klenow片段T4DNA聚合酶TaqDNA聚合酶（应用最广）其他DNA聚合酶：TthDNA聚合酶VentDNA聚合酶PfuDNA聚合酶等TaqDNA聚合酶的特性酶活性•该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为94KDa。•其比活性为200000单位/mg。75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒。温度过高(90℃以上)或过低(22℃)都可影响TaqDNA聚合酶的活性。热稳定性•有良好的热稳定性，在92.5℃、95℃、97.5℃时，PCR混合物中的TaqDNA聚合酶分别经130min，40min和5～6min后，仍可保持50%的活性。•TaqDNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因。离子依赖性•TaqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，对Mg2+浓度非常敏感。•