糖原合酶激酶3β和腺瘤性结肠息肉病蛋白在气道上皮细胞机械损伤修复

生理学报ActaPhysiologicaSinica,April25,2007,59(2):197-203(No.30470757).*Correspondingauthor.Tel:[phone];Fax:[phone];E-mail:[e-mail]糖原合酶激酶3β和腺瘤性结肠息肉病蛋白在气道上皮细胞机械损伤修复过程的时空分布朱敏，李建莎，田丹，马燕，李娜萍，吴人亮*华中科技大学同济医学院病理学系，卫生部呼吸系统疾病重点实验室，武汉430030摘要：为了探讨糖原合酶激酶3β(glycogensynthasekinase3β,GSK3β)和腺瘤性结肠息肉病(adenomatouspolyposiscoli,APC)蛋白在气道上皮细胞(airwayepithelialcells,AECs)损伤和修复中的作用，我们采用机械划线损伤的方法建立体外气道上皮损伤修复模型，采用Westernblot、免疫荧光双标共聚焦成像和免疫沉淀的方法观察损伤修复过程中APC蛋白和GSK3β在AECs中表达及分布的动态变化。结果显示：(1)用Westernblot方法观察到划线损伤0.5h后即有GSK3β磷酸化增强(P0.05)，6h达到高峰(P0.05)，持续到12h(P0.05)，24h开始下降，而GSK3β总量大致保持一致。(2)在免疫荧光双标共聚焦成像实验中，划线损伤0h组APC蛋白主要表达于胞浆，而划线损伤6h后APC蛋白主要聚集于损伤前沿区的迁移活跃细胞。(3)免疫共沉淀的实验结果显示，划线损伤0h时GSK3β和APC蛋白能共同沉淀，但在划线损伤6h之后，两者发生了分离。以上结果表明：划线损伤后AECs立即启动修复过程，此时GSK3β的活性被抑制，促使APC蛋白游离出来；游离出来的APC蛋白则与微管正极结合，增加了微管的稳定性，从而调节细胞骨架运动，促进气道上皮的损伤修复。关键词：糖原合酶激酶3β；腺瘤性结肠息肉病蛋白；气道上皮细胞；损伤修复中图分类号：R322.3Spatial-temporaldistributionofglycogensynthasekinase3βandadenomatouspolyposiscoliproteinareinvolvedintheinjuryandrepairofairwayepithelialcellsinducedbyscratchingZHUMin,LIJian-Sha,TIANDan,MAYan,LINa-Ping,WURen-Liang*DepartmentofPathology,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,andKeyLaboratoryofPulmonaryDiseaseofMinistryofHealthofChina,Wuhan430030,ChinaAbstract:Toinvestigatetherolesofglycogensynthasekinase3β(GSK3β)andadenomatouspolyposiscoli(APC)proteininwoundrepairofairwayepithelialcells(AECs),weestablishedawoundmodelofairwayepitheliuminvitro.Thenthefollowingtestswereundertaken:(1)WesternblotwasusedtodetectthelevelsoftotalGSK3βandphosphorylatedGSK3βinhumanbronchialepithelial(16HBE)cells;(2)ThelocalizationsofAPCproteinwasobservedbyusingimmunofluorescencetechnique;(3)ImmunoprecipitationwasusedtoinvestigatetherelationshipbetweenAPCproteinandGSK3βduringtherepairof16HBEcells.Theresultswereasfollows:(1)ThelevelofphosphorylatedGSK3βincreased0.5hafterscratching(P0.05),reachedamaximumat6h(P0.05),andmaintaineduntil12h,whilethetotallevelofGSK3βremainedconstant;(2)ResultsofimmunofluorescencestudyshowedthatAPCproteinclusteredwithtubulinintheregionofthemigratingleadingcells6hafterscratching,whichwasdissimilarwiththatinthecells0hafterscratching;(3)GSK3bandAPCproteinwereimmunoprecipitatedandanalysedonSDS-PAGE.WefoundthatGSK3bandAPCproteinwereprecipitated,indicatingthatthetwoproteinsexistedinacomplex.Afterscratching,dissociationofthetwoproteinsoccurred.Takentogether,weconcludethatscratchingcausedadecreaseinphosphorylationofGSK3β,andthatreducedphosphorylationofGSK3bpromotedAPCproteintobindtotheplusendsofmicrotubulesandstabilizethegrowingends.TheseobservationssuggestthatAPC生理学报ActaPhysiologicaSinica,April25,2007,59(2):197-203198proteinandGSK3βmaysynergisticallyplayanimportantroleintherepairofairwayepithelium.Keywords:glycogensynthasekinase3β;adenomatouspolyposiscoliprotein;airwayepithelialcells;injuryandrepair多种因素(机械损伤、香烟烟雾、大气污染和感染等)均可引起气道黏膜上皮细胞的损伤，从而引起急性或慢性支气管炎。在损伤修复过程中，气道上皮细胞(airwayepithelialcells,AECs)将会发生迁移、分裂增生和分化，以重新覆盖受损区域[1]。而损伤周围的细胞迁移和增殖都有赖于微管及其相关蛋白之间复杂的相互作用[2,3]。近年研究[3,4]显示，腺瘤性结肠息肉病(adenomatouspolyposiscoli,APC)蛋白可以通过其分子羧基末端的微管结合区域与微管正极直接结合，调节微管组装、引发微管成束以及增加微管稳定性，被视为一种新的微管相关蛋白[4,5]。糖原合酶激酶3(glycogensynthasekinase3,GSK3)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，有α和β两种亚型，在细胞内呈组成性激活，具有广泛的底物，参与物质代谢、细胞增殖和细胞运动等活动[6]。研究表明GSK3β能够使多种微管相关蛋白磷酸化，减弱它们稳定微管的能力，进而影响损伤修复中细胞迁移等细胞活动[7]。APC蛋白为GSK3β的底物之一，被GSK3β磷酸化之后与微管的结合减少，不利于微管的稳定[8]。我们的前期工作显示GSK3在肺组织中广泛表达，在AECs中尤为丰富[9]，并且参与吸烟所致大鼠气道上皮损伤修复过程[10]，提示GSK3β可能在AECs的生长、增殖和分化等过程中发挥作用。因此，我们通过体外机械损伤AECs，建立气道上皮损伤修复的模型，采用Westernblot、荧光双标共聚焦成像和免疫沉淀方法研究AECs损伤后GSK3β的活性、APC蛋白的分布变化，进一步探讨二者在AECs损伤修复中的可能机制。1材料与方法1.1主要试剂　　DMEM/F12(1:1)和新生牛血清为Gibco产品；蛋白酶抑制剂cocktail购自Calbiochem公司；BCA试剂盒和增强化学发光(enhancedchemi-luminescence,ECL)试剂盒为Pierce公司产品；蛋白分子量标准购自Invitrogen公司；兔抗鼠APC蛋白多克隆抗体、兔抗鼠GSK3β多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG、羊抗兔IgG和FITC标记羊抗鼠IgG均购自SantaCruz公司；抗磷酸化GSK3β(Ser-9-GSK3)兔多克隆抗体为CellSignalTechnology公司产品；TRITC标记山羊抗兔IgG和Hoechst33258购自美国Pierce公司；鼠抗人β-tubulin单克隆抗体购自福州迈新生物公司。1.2AECs的培养　　人气道上皮细胞(humanbronchialepithelial)株16HBE由广州医学院化学致癌研究所蒋义国教授惠赠，用含10%新生小牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基，置于37℃、5%CO2中培养，每1~2d换液一次，并以0.25%胰蛋白酶消化传代。待培养的细胞生长至70%~90%融合状态时进行实验，每次实验均采用同一代细胞，并用不同批次的细胞重复实验。1.3气道上皮损伤修复模型的建立　　参照Desai等[11]的方法，用微量加样器吸头(2μLtips)在培养的单层上皮细胞上划多条宽约300μm的“伤痕”，诱导细胞的损伤修复过程。相差显微镜下可见划线后3h即有细胞爬出，6h最为显著，24h时迁移细胞基本可以掩盖划痕。1.4Westernblot检测AECs中GSK3β和磷酸化GSK3β的表达　　(1)样本收集：取出各组处理细胞，PBS洗涤两遍后，0.1%胰酶/0.02%EDTA消化，PBS洗涤，收集细胞于1.5mL离心管中，4000r/min离心3min，弃上清。PBS重悬沉淀，再次离心收集细胞。尽量吸弃PBS，加入50~60μL冰冷的裂解液[50mmol/LTris-HCl(pH8.0)，100mmol/LNaCl，1mmol/LEDTA，1mmol/LDTT，1%TritonX-100，0.1%SDS，50mmol/LNaF，1mmol/LNaVO3，蛋白酶抑制剂]重悬细胞团，补足裂解液至100~120μL，振荡10s，置于冰上10min。然后超声破碎细胞，60W，3~5次。接着12000g，4℃离心10~15min。取上清分装，即为细胞总蛋白。(2)SDS-PAGE电泳及转膜：提取的蛋白样本用BCA法测蛋白浓度，取等量蛋白上样。标准方法电泳，再转移蛋白于硝酸纤维素膜上。(3)免疫显色反应：硝酸纤维素膜用含有5%脱脂奶粉的TBST室温封闭1h；分别与GSK3β(1:1000)和磷酸化GSK3β(1:500)抗体4℃孵育过夜；然后将硝酸纤维素膜置于HRP标记的相应二抗溶液中，室温1h，按照ECL试剂盒说明书进行反应，X线胶片曝光洗199朱敏等：GSK3β和APC蛋白在气道上皮细胞机械损伤修复过程的时空分布片。胶片条带经扫描、编辑和打印。1.5荧光双标共聚焦成像观察APC蛋白