生物化学经典实验DNA琼脂糖凝胶电泳的原理、步骤、试剂配制、结果分析分析

DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理琼脂糖为链状多糖→绳状琼脂糖束→大网孔型凝胶——分离、鉴定、纯化DNA在pH值为8.0～8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。实验原理当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。影响DNA迁移率的因素影响DNA迁移率的因素：DNA分子的大小、构象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成等缓冲液pHDNApI，DNA带负电荷，迁移率与分子量对数成反比DNA分子构象影响迁移率：共价闭环DNA线状DNA开环DNADNA片段越长，泳动速度越慢在低电压时，泳动速度与电场强度成正比不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围琼脂糖浓度（W/V,%）分离范围（kb）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。嵌入染料的存在荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在无离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动;在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。琼脂糖凝胶中DNA的观察溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下桔红色荧光主要实验器材电泳仪电泳槽缓冲液琼脂糖凝胶槽梳子取液器溴酚蓝电泳槽结构缓冲溶液配制表电泳指示剂核酸电泳常用的指示剂有两种:溴酚蓝(bromophenolblue,Bb)呈蓝紫色；二甲苯腈(xylenecyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。胶浓（%）溴酚蓝二甲苯腈0.61kb10.6kb2kb1.40.2kb1.6kb20.15kb操作步骤琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB凝胶板的制备：加梳子，倒胶样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝加样：加样端为负极（黑）电泳：5V/cm观察：紫外灯下观察，照相溶胶准备胶槽凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml铺胶凝胶凝固后取出梳子加电泳缓冲液准备样品点样电泳注意观察溴酚蓝染液的迁移紫外灯下观察电泳结果照相