第三章-基因载体的选择与构建

1第三章基因载体(Vectors)的选择与构建《基因工程原理》山东理工大学生命科学学院2第三章基因载体的选择与构建一载体的一般特性二质粒载体三λ噬菌体载体四cos质粒（cosmid）五人造染色体载体（酵母人工染色体，细菌人工染色体载体和噬菌体人工染色体载体）3一、载体的一般特性分子克隆载体是可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子功能:外源基因提供进入受体细胞的转移能力为外源基因提供在受体细胞的复制能力或整合能力为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力4载体(vector)DNA，能在宿主细胞中进行自我复制和表达克隆载体、表达载体原核载体：质粒(pBR322,pUC…）噬菌体（λ，M13）等。真核载体：动物病毒载体pLXSN等BAC、YAC、PAC等。5（一）、发展概况第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,ColE1,pCR,pBR313第二阶段：增大载体容量，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因第三阶段：进一步完善载体的功能以满足基因工程克隆中的不同要求6（二）、载体的结构特点至少有一个复制起点，至少可在一种生物体中有效复制，稳定遗传至少有一个限制酶识别位点，供外源DNA插入至少有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞具有较小的分子量和较高的拷贝数具有对受体细胞的可转移性,提高载体导入受体细胞的效率7一个理想的载体应具备以下的特点:(1)能自主复制;(2)易于分离和纯化;(3)含有可供选择的遗传标记;(4)含酶切位点;(5)不含与复制无关的区域;(6)不影响宿主的生长和繁殖.8（三）、载体的种类在基因工程中所用的载体，主要有，(1)质粒(Plasmid)，主要指人工构建的质粒。(2)噬菌体的衍生物。(3)cosmid(柯斯质粒)。(4)动物病毒。(5)人工染色体9（四）、遗传标记基因1.标记基因的作用：指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子102.标记基因的种类：抗性标记基因营养标记基因生化标记基因113.常用的遗传标记基因四环素抗性基因（Tetr）抑菌剂，Tetracycline可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。抑制细胞蛋白质合成，细胞停止生长。四环素抗性基因编码一种399AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。12氨苄青霉素抗性基因（Ampr）杀菌剂，Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性，干扰细胞分裂，杀死细胞。Ampr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化β-内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。13氯霉素抗性基因（Cmr）抑菌剂，Chloramphenicol可结合在核糖体50S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。14卡那霉素(Kanr)、新霉素(Neor)、G418抗性基因(G418r)杀菌剂，Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上，导致mRNA发生错读。来自转座子Tn5和Tn903的Kanr抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。15β-半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZα）◇β-半乳糖苷酶基因编码1021个氨基酸◇其氨基末端称为α链，羧基末端称为β链◇α链负责将β链装配为四聚体◇单独的β链不具酶活性，只有在α链的帮助下组装成β4才具有酶活性——α-互补作用◇为α链编码的基因称之为lacZα(编码145AAs)16β-半乳糖苷酶基因的优点◇酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside◇LacZα和β链基因的分别表达通常以LacZα作为载体的遗传标记基因，而由宿主细胞表达β链17葡萄糖苷酸酶基因（GUSgene）β-葡萄糖苷酸酶可将X-Gluc（5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）降解为兰色产物适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因18Eucalyptusoccidentalis（桉树）19荧光素酶基因（luciferaseGene）荧光素酶或由萤火虫产生，可催化荧光素氧化，并产生荧光。或由发光细菌（Photobacteriumfischeri）产生。发光是胞内荧光酶催化氧化反应。20tobacco21绿色荧光蛋白基因（GFP）GFP是由水母产生的一种可发光的蛋白质22二质粒载体质粒（plasmid)(1~500kb)是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子，广泛存在于细菌细胞中。在霉菌、蓝藻、酵母和动植物细胞中。目前对细菌质粒研究的较为深入，多使用大肠杆菌质粒为载体。231.质粒形状质粒：环状质粒、线性质粒DNA质粒、RNA质粒Commonplasmidvectorscancarryupto15kbforeignDNA（一）质粒一般特性242.野生型质粒具有下列基本特性:自主复制:质粒DNA含有自己的复制起点(ori)以及控制复制频率的基因,能够摆脱宿主染色体DNA复制调控系统而进行自主复制,并在宿主细胞产生不同的拷贝数可转移性:质粒可通过细菌的接合作用从一个宿主转移到另一个宿主不相容性:具有相同或相似复制子结构的两种不同的质粒不能够稳定存在于同一个细胞25大多数质粒的复制与细菌染色体复制使用同一套酶,质粒的复制有两种控制类型:(1)严紧型控制(stringentcontrol):与宿主染色体同步复制，因此每个宿主细胞中只有一个或几个质粒拷贝;(2)松弛型控制(relaxedcontrol):可自主复制，因此每个宿主细胞10~200个质粒拷贝，此对分子克隆有利。在宿主停止合成蛋白质时宿主染色体和严紧型质粒都不复制，而松弛型质粒可继续复制。26（二）重要的大肠杆菌质粒载体pSC101ColE1质粒载体pBR322pUC质粒载体pGEM－3Z质粒穿梭质粒载体271.质粒的改造、构建与使用删除非必需区，减小质粒的分子量，提高外源DNA的装载量(一般来说，大于20kb的质粒很难导入受体细胞)加入遗传标记基因在标记基因内引入具有多种限制酶识别及切割位点的DNA序列，即多克隆位点(multiplecloningsites，MCS)根据不同要求，插入特殊的基因表达调控序列28理想的质粒载体，应具备以下几个条件：(1)能自主复制，即本身是复制子(2)具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能；(3)在基因组中有1-2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征。(4)分子量要小，多拷贝，易于操作。292.质粒的命名(1)人工组建的质粒人工组建的质粒的第一个字母是质粒英文名字（plasmid）的第一个字符p，用小写。p后有2个字母是大写，表示质粒的作者和实验室名称，再其后为质粒的编号。例：pXYp109；pSC101等天然载体质粒的第一个字母大写，且质粒符号用括号括起来。如（C01E1）。农杆菌质粒用p加Ti（Tumerinducing）或At（Agrobacteriumtumefacions）表示，如pTiC58。(2)天然载体质粒30pSC101(plasmidStanleyCohen)严紧型、低拷贝，平均每个细胞1～2个copy。9.09kb含有抗四环素基因(tetr)和7种内切酶的单一切点。HindIII、BamHI和SalI3.常用的质粒载体31EcoRIBoyer和Cohen的实验pSC101pR6-5大肠杆菌32ColE1质粒载体松弛型，多拷贝1000～3000copy选择标记33pBR322特点：多种抗药标记分子量低：4363bp高拷贝多单酶切位点不影响复制34pBR322：它由三部分组成：来自pSCl01的四环素抗性基因Tetr来自ColEl的衍生物pMBl的松弛复制起点ori来自RSF2124的氨苄青霉素抗性基因Ampr35pBR322质粒载体的构建过程：1、以pMB1为基础，引入Rldrd19质粒的Tn3易位子。得到pMB3；2、pMB3通过EcoRI去掉无用片段，形成pMB8质粒（2.6kb）；3、pSC101在EcoRI消化产生了含有tetr抗性的DNA片段，和pMB8整合形成了pMB9（5.3kb）。4、在pMB9上引入pSF2124的Tn3易位子，但Tn3可以来也可以走，切去了Tn3中转位酶基因，形成了pBR312质粒，除去BamHI位点。5、把pBR313的PstI位点除去，得到pBR318。除去EcoRII，得到pBR320。318与320重组。36pUC系列载体是在pBR322基础上衍生出来的一系列质粒载体pUC质粒载体的优点:◇具有更小的分子量和更高的拷贝数（2.7kb,500~700copies/cell）◇适用于组织化学法检测重组体，一步实现对阳性克隆的鉴定◇具有多克隆位点区（MCS）37pUC质粒载体pBR322的复制起点ampr，但不含酶切位点lacZ的启动子和编码α-肽链的序列。多克隆位点（MCS）38pGEM系列载体pGEM系列载体是一种与pUC系列十分类似的小分子的质粒载体。它具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。由于这两个启动子分别位于lacZ'基因中多克隆位点区的两侧(图)39pGEM-TpGEM用途多，能在离体情况下合成RNA、ssDNA。含SP6和T7RNA聚合酶的启动子，位于β-半乳糖苷酶的α-肽段的两测。40pGEM-T多克隆位点的序列4142穿梭质粒载体人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。434.大肠杆菌中的表达载体表达载体应含有：（1）强启动子（2）在启动子下游区和ATG上游区有一个好的SD序列。（3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。44（一）噬菌体的生物学特性噬菌体英文名叫做Bacteriophage（简称phage）。它的DNA分子除了复制起点之外，还有编码外壳蛋白质的基因。三、噬菌体载体45噬菌体最常见的是双链线性DNA。除此之外，还发现有双链环形DNA、单链环形DNA、单链线性DNA以及单链RNA等多种形式的噬菌体。有些噬菌体的DNA碱基并不是由标准的A、T、G、C四种碱基组成。噬菌斑，即感染的细菌细胞被噬菌体裂解之后留下的空斑。46Lifecycle:◇lyticcycle(裂解周期）◇lysogeniccycle（溶源周期）47噬菌体有的噬菌体（phage）基因组较大，如λ噬菌和T噬菌体等；有的则较小，如M13、f1、fd噬菌体等。用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。只能利用寄主的核糖体、合成蛋白质的因子、各种氨基酸及能量代谢体系进行生长和增殖。481.λ噬菌体的一般生物学特性48514bp，线状双链DNA线状分子两端具有12n.t的5‘-端突起的可互补的粘性末端（cohensiveend，cos），该末端称为cos位点，可被λ编码的A蛋白所识别当λ侵入宿主细胞后，线状DNA分子借助粘性末端连接成环状分子（二）λ噬菌体载体49λDNAcos位点cos位点λ噬菌体有61个基因，其中有1/3的区域是其裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是λ噬菌体可作为基因载体的依据502.λDNA作载体的优缺点和解决办法优点：◇λDNA进入细菌细胞容易◇由于λ能裂解宿主细胞，因此提取DNA或基因表达产物都比较容易◇用λ噬菌体颗粒包装的DNA易于长期保存51缺点及解决措施：◇λ头部只能容纳自