高通量测序

高通量测序技术及其应用上海业力生物科技有限公司ShanghaiYelibio-technologyCo.Ltd李海阔博士主要报告内容1测序简介2高通量测序原理简介以及比较3一些应用实例4前景展望1测序简介经典的DNA测序技术Sanger法化学法FrederickSanger（1918~）WalterGilbert（1932~）Sanger测序技术PCR末端终止技术+电泳检测技术单个片段序列测定最高通量：小于4MB/天基于平板胶的测序技术96通道毛细管阵列HGP项目：20世纪90年代美国能源部资助启动人类基因组计划，六个国家的科学家耗资4.37亿，于2000年完成人类基因组工作草图。方法和结果：应用分层shotgun+Sanger测序法，结果预测了31,000个基因，证明基因组的95%是非编码序列。意义：人类基因组测序的完成标志着分子医学时代的到来；此项目也催生了高通量测序技术。Nature(2001)409:860-921人类基因组从头测序分析分层的shotgun测序法刺激DNA测序技术发展的四个方面人类基因组计划的出现，使人们面临了巨大的经费问题，因为传统的Sanger测序法无论如何优化，也无法大幅度降低测序费用；人类以及其它主要模式生物参考序列数据库的建立使得短片段作图成为可能，这极大地促进了短片段测序技术的发展；不断涌现的新型分子生物学技术极大地促进了分子生物学的发展，随之而来的越来越多的比如基因变异、RNA表达、蛋白与DNA相互作用以及染色体构象等等生物学现象需要人们用高通量DNA测序手段去解释，这也极大地促进了新型测序技术的发展；其它学科、各项相关技术的发展，例如显微镜技术、表面化学技术、核苷生化技术、聚合酶工程技术、计算机技术、数据储存及分析技术等，为DNA测序技术提供了极大的支持。2高通量测序原理简介以及比较高通量测序简介•高通量测序:一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，又称为下一代测序技术，其使得可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序。•High-throughputSequencing•NextGenerationSequencing•DeepSequencing高通量测序技术的起源与发展•1992年LynxTherapeuticsMPSS•2003年PolonySequencing（哈佛）•2005年454Pyrosequencing•2006年SolexaSequencing-by-Synthesis•2007年ABISOLiD•2008年HelicostSMSSequencing•2010年IontorrentSemiconductorSequensing•2011年PacificBiosciencesSMRTSequensing•Samplefragmentation•Librarypreparation•Sequencingreaction•DataanalysisRoche454焦磷酸测序PyrophosphateSequencingIlluminaSolexa合成测序SequencebySynthesizeABISOLiD连接法测序SequencebyLigation目前成熟的三大高通量测序技术简介传统的Sanger测序法及新一代DNA测序技术工作流程图比较：（a）高通量鸟枪Sanger测序法。首先基因组DNA被随机切割成小片段分子，接着众多小片段DNA被克隆入质粒载体，随后转化到大肠杆菌中。最后培养大肠杆菌提取质粒，进行测序。每一个测序反应都在只有几微升的反应体系中完成。测序后获得一系列长短不一的末端标记有荧光的片段，最后通过对每一个延伸反应产物末端荧光颜色进行识别来读取DNA序列。（b）鸟枪循环芯片测序法。首先将基因组DNA随机分割成小片段DNA分子，然后在这些小片段DNA分子的末端连接上普通的接头，最后用这些小片段DNA分子制成polony芯片。每一个polony中都含有一个小片段DNA分子的许多个拷贝。许多这样的polony集合在一起就形成了polony芯片。这样一次测序反应就可以同时对众多的polony进行测序。然后与sanger法中一样，通过对每一个延伸反应产物末端荧光颜色进行识别来读取出DNA序列。重复上述步骤就能获得完整的序列。一般高通量测序技术流程ShotGun文库构建DNA片段固定簇序列读取反应图像获得和处理序列组装和比较单条模板扩增1234TTTT…TGCT…454Pyrosequencing•基于磁珠的焦磷酸测序：A磁珠制备设备B454测序仪C454测序原理454新测序方法用到的焦磷酸测序原理焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是由Nyren等人于1987年发展起来的一种新型的酶联级联测序技术。红色单链表示模板链，引物以黑色表示，DNA聚合酶以绿色的椭圆形表示。每当掺入一个碱基（如图中蓝色的G）时，就会释放出焦磷酸（PPi），然后被磷酸化酶（sulfurylase，图中蓝色箭头所示）转化成ATP。然后荧光素酶（图中红色箭头所示）就可以在ATP参与下将荧光素转变成氧化荧光素，同时发光也会被测序仪检测到。测序反应是通过释放PPi经过ATP硫酸化酶和荧光素酶作用发光，向反应体系中加入1种dNTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3‘末端，同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi），CCD捕捉拍照。反应是连续的，所以遇到连续的碱基如polyA时，易产生误差。454sequencing：EmulsionPCR(emPCR)MixDNALibrary&capturebeads(limiteddilution)“Breakmicro-reactors”IsolateDNAcontainingbeadsGenerationofmillionsofclonallyamplifiedtemplatesoneachbeadNocloningandcolonypickingCreate“Water-in-oil”emulsion+PCRReagents+EmulsionOilPerformemulsionPCRAdaptercarryinglibraryDNAABMicro-reactorsAdaptercomplementEnrichAnnealSeqprimerCentrifugeStepLoadEnzymeBeads454sequencing：DepositionofDNAbeadsintothePicoTiter™PlateLoadbeadsintoPicoTiter™Plate454的特点与主要应用•读长较长，400－600bp•通量较低，1Run1M序列，400－600Mb•相对成本较高•主要应用：denovo测序IlluminaSolexa简介•桥式PCR•边合成边测序•可逆终止物HiSeq2000ClonalSingleMoleculeArrays单分子克隆~1000moleculesper~1µmcluster~1000clustersper100µmsquare~40millionclustersperexperimentPrepareDNAfragmentsLigateadaptersAttachsinglemoleculestosurfaceAmplifytoformclusters20micronsSequenceSequencing-by-Synthesis(SBS)5’GTCAGTCAGTCAGT3’5’CAGTCATCACCTAGCGTAFirstbaseincorporatedCycle1:AddsequencingreagentsRemoveunincorporatedbasesDetectsignalCycle2-n:Addsequencingreagentsandrepeat1、每轮测序反应加入四种带有荧光标记的dNTP，末端带有可以被去除的阻断基团2、每轮反应只能整合一个核苷酸，仪器读取相应的荧光信号3、信号读取结束，用化学方法去除阻断基团，进行下一轮测序反应ReversibleTerminatorChemistry可逆终止反应OPPPHNNOOcleavagesitefluor3’blockNextcycleIncorporationDetectionDeblock;fluorremovalODNAHNNOO3’O5’free3’endXOH•All4labellednucleotidesin1reaction123789456TTTTTTTGT…TGCTACGAT…Theidentityofeachbaseofaclusterisreadofffromsequentialimages根据每个点每轮反应读取的荧光信号序列，转换成相应的DNA序列BasecallingfromtherawdataIlluminaSolexa测序流程Solexa的特点与主要应用•读长较短，100－150bp•通量高，25G每天，120-150G每Run•主要应用：RNA测序、表观遗传学研究ABISOLiD简介•SOLiDSequencingbyOligoLigation/Detection•Oligo连接测序：通过连接酶连接，再对oligo上荧光基团进行检测SOLiD5500xlABISOLiD测序前期制备A样品片段化磁珠连接B乳化PCR3‘末端修饰C磁珠富集转到测序玻片1024种8碱基探针4色荧光，4种双核苷酸，每色荧光有256个探针(4^6)SOLiD利用探针的连接反应读取模板的DNA序列连接法测序（一）每个探针进行检测的两个碱基后面有三个匹配碱基，因此一条测序引物读取的序列是不完整的测序引物与adapter退火探针连接，检测荧光切除荧光基团第二轮探针连接，检测荧光切除荧光基团连接法测序（二）测序引物沿着Adapter移动5次，确保每个位点都被检测SOLiD的特点与主要应用•读长较短，50-75bp•精度高，可达Q40•通量高，20-30G每天，1Run可达120G•主要应用：基因组重测序、SNP检测等三种平台的技术差异平台454SolexaSOLiDPCR磁珠乳化PCR桥式PCR磁珠乳化PCR测序载体磁珠玻片玻片测序方式焦磷酸、荧光可逆终止物、荧光连接酶、荧光结果序列FastQ（数据保存格式，保护序列本身和测序质量）FastQCSFastQ三种平台的效能参数差异平台读长通量周期精度SolexaHiSeq2000Single-end:1x35bpPaired-end:2x50bpPaired-end:2x100bp25Gb/d~1.5d~4d~8d•50bp85%以上Q30•100bp80%以上Q30SOLiD5500xlSingle-end:75bpPaired-end:75x35bpMate-pair:60x60bp20–30Gb/d1d/1lane7d/12lane7d/12laneQ40454GSFLX400-600bp400–600Mb/Run10hQ20Advantage&disadvantage454sequencing•读取长度大，400bp•可以对未知基因组进行从头