生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程

生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程本规程适用于人用生物制品生产/检定用动物细胞基质，包括具有细胞库体系的细胞基质及原代细胞。细胞基质系指可用于生物制品生产/检定的所有动物或人源的连续传代细胞系、二倍体细胞株及原代细胞。生产非重组制品所用的细胞基质，系指来源于未经修饰的用于制备其主细胞库的细胞系/株和原代细胞。生产重组制品的细胞基质，系指含所需序列的、从单个前体细胞克隆的转染细胞。生产的细胞基质，系指通过亲本骨髓瘤细胞系与另一亲本细胞融合的杂交瘤细胞系。一、对生产用细胞库细胞基质总的要求用于生物制品生产的细胞系/株均须通过全面检定，须具有如下相应资料，并经国务院药品监督管理部门批准。（一）细胞系/株历史资料的要求1.细胞系/株来源资料应具有细胞系/株来源的相关资料，如细胞系/株制备机构的名称，细胞系/株来源的种属、年龄、性别和健康状况的资料。这些资料最好从细胞来源实验室获得，也可引用正式发表文献。人源细胞系/株须具有细胞系/株的组织或器官来源、种族及地域来源、年龄、性别及生理状况的相关资料。动物来源的细胞系/株须具有动物种属、种系、饲养条件、组织或器官来源、地域来源、年龄、性别、病原体检测结果及供体的一般生理状况的相关资料。如采用已建株的细胞系/株，应从具有一定资质的细胞保藏中心获取细胞，且应提供该细胞在保藏中心的详细传代过程，包括培养过程中所使用的原材料的相关信息，具有细胞来源的证明资料。2．细胞系/株培养历史的资料应具有细胞分离方法、细胞体外培养过程及建立细胞系/株过程的相关资料，包括所使用的物理、化学或生物学手段，是否有外源添加序列，以及细胞生长特征、生长液成分、选择细胞所进行的任何遗传操作或选择方法等。同时还应具有细胞鉴别、检定、内源及外源因子检查结果的相关资料。应提供细胞培养液的详细成分，如使用人或动物源成分，如血清、胰蛋白酶、水解蛋白或其他生物学活性的物质，应具有这些成分的来源、制备方法及质量控制、检测结果和质量保证的相关资料。（二）细胞库的建立细胞库的建立可为生物制品的生产提供已标定好的、细胞质量相同的、能持续稳定传代的细胞种子。1．原材料的选择建立细胞库的各种类型细胞的供体均应符合本规程‘细胞的检定’中相关规定。神经系统来源的细胞不得用于生物制品生产。细胞培养液中不得使用人血清，如需使用人血白蛋白，则须使用有批准文号的合格制品。消化细胞用胰蛋白酶应进行检测，证明其无细菌、真菌、支原体或病毒污染。特别应检测胰蛋白酶来源的动物可能携带的病毒，如细小病毒等。用于生物制品生产的培养物中不得使用青霉素或β-内酰胺(β-Lactam)类抗生素。配制各种溶液的化学药品应符合《中国药典》（二部）或其他相关国家标准的要求。2．细胞操作的环境要求细胞培养的操作应符合中国《药品生产质量管理规范》的要求。生产人员应定期检查身体。在生产区内不得进行非生产制品用细胞或微生物的操作；在同一工作日进行细胞操作前，不得操作或接触有感染性的微生物或动物。3．建立细胞库细胞库为三级管理，即原始细胞库、主细胞库及工作细胞库。如为引进的细胞，可采用主细胞库和工作细胞库组成的二级细胞库管理。在某些特殊情况下，也可使用MCB一级库，但须得到国务院药品监督管理部门的批准。（1）原始细胞库(PCB)由一个原始细胞群体发展成传代稳定的细胞群体，或经过克隆培养而形成的均一细胞群体，通过检定证明适用于生物制品生产或检定。在特定条件下，将一定数量、成分均一的细胞悬液，定量均匀分装于安瓿，于液氮或-130℃以下冻存，即为原始细胞库，供建立主细胞库用。（2）主细胞库(MCB)取原始细胞库细胞，通过一定方式进行传代、增殖后均匀混合成一批，定量分装，保存于液氮或-130℃以下。这些细胞必须按其特定的质控要求进行全面检定，应合格。主细胞库用于工作细胞的制备，每个生产企业的主细胞库最多不得超过两个细胞代次。（3）工作细胞库(WCB)工作细胞库的细胞由MCB细胞传代扩增制成。由MCB的细胞经传代增殖，达到一定代次水平的细胞，合并后制成一批均质细胞悬液，定量分装于安瓿或适宜的细胞冻存管，保存于液氮或-130℃以下备用，即为工作细胞库。每个生产企业的工作细胞库必须限定为一个细胞代次。冻存时细胞的传代水平须确保细胞复苏后传代增殖的细胞数量能满足生产一批或一个亚批制品。复苏后细胞的传代的水平应不超过批准的该细胞用于生产限制最高限定代次。所制备的WCB必须经检定合格（见本规程‘细胞检定’中有关规定）后，方可用于生产。4．细胞库的管理每种细胞库均应分别建立台帐，记录放置位置、容器编号、分装及冻存数量，取用记录等。细胞库中的每支细胞安瓿或细胞冻存管均应注明细胞系/株名、代次、批号、编号、冻存日期，储存容器的编号等。冻存前细胞活力应在90%以上，复苏后细胞存活率应不低于85%。冻存后的细胞，应至少作一次复苏培养并连续传代至衰老期，检查不同传代水平的细胞生长情况。主细胞库和工作细胞库分别存放。非生产用细胞应与生产用细胞严格分开存放。（三）细胞检定细胞检定主要包括以下几个方面：细胞鉴别、外源因子和内源因子的检查、致瘤性检查等。必要时还须进行细胞染色体核型检查。这些检测内容对于MCB细胞和WCB细胞及生产限定代次细胞均适用。细胞检定的基本要求见下表1。细胞库建立后应至少对MCB细胞及生产终末细胞进行一次全面检定。每次从MCB建立一个新的WCB，均应按规定项目进行检定。表1、细胞检定项目要求检测项目MCBWCB生产终末细胞*细胞鉴别+++无菌检查+++支原体检查+++病毒污染检查外源病毒体外培养法+++体内接种法+-+种属特异性病毒+-+逆转录病毒+-+细胞致瘤性+-+*生产终末细胞:是指按生产规模制备的终末代次细胞。1．细胞鉴别试验新建细胞系/株、细胞库(MCB和WCB)和生产终末细胞应进行鉴别试验，以确认为本细胞，无其他细胞的交叉污染。细胞鉴别试验方法有多种，包括细胞形态、生物化学法(如同工酶试验)、免疫学检测(如HLA、种特异性抗血清)、细胞遗传学检测(如染色体核型、标记染色体检测)、遗传标志检测(如DNA指纹图谱、STR图谱、基因组二核苷重复序列)等。可选其中一种或几种方法，但均须经国家药品检定机构认可。细胞表型特征与遗传学特征相结合来判断，更有利于细胞鉴别。2．无菌检查取混合细胞培养上清液样品，依法检查，应符合要求（附录XIIA）。3．支原体检查取细胞培养上清液样品，依法检查，应符合要求（附录XIIB进行），应为阴性。4．细胞内、外源病毒因子检查应注意检查细胞系/株中是否有来源物种中潜在的可传染的病毒，以及由于操作带入的外源性病毒。细胞进行病毒检查的种类及方法，须根据细胞的种属来源、组织来源及细胞特性决定。（1）细胞形态观察及血吸附试验取混合瓶细胞样品，接种至少6个细胞培养瓶或培养皿，待细胞长成单层后换维持液，持续培养两周。如有必要,可以适当换液。每日镜检细胞，细胞应保持正常形态特征。如为贴壁细胞或半贴壁细胞，细胞至少培养14天后，分别取1/3细胞培养瓶或培养皿，用0.2%~0.5%豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液进行血吸附试验。加入红细胞后置2~8℃30分钟，然后置20~25℃30分钟，分别进行镜检，观察红细胞吸附情况，结果应红细胞吸附应为阴性。新鲜红细胞在2~8℃保存不得超过7天,且溶液中不应含有钙或镁离子。（2）不同细胞传代培养法检测病毒因子将待检细胞分别接种下列三种单层细胞，包括猴源细胞、人源二倍体细胞和同种属同组织类型来源的细胞。每种单层细胞接种至少107个含有原细胞培养上清液的活细胞悬液或细胞裂解物，每种细胞至少接种2瓶。接种供试品量应占维持液的1/4以上，培养至少14天。试验应设立病毒阳性对照，包括可观察细胞病变的病毒阳性对照、血凝阳性对照及血吸附阳性对照。如细胞裂解物对单层细胞有干扰，则应排除干扰因素。在培养第7天时，分别取每种接种的单层细胞上清液各一瓶，分别接种于新鲜制备的相应的单层细胞上，继续培养7天，观察细胞病变并进行细胞形态观察及血吸附试验。每种接种的单层细胞不得出现细胞病变，血吸附试验应均为阴性。若待检细胞已知可支持人巨细胞病毒(CMV)的生长，则应在接种人二倍体细胞后至少观察28天，应无细胞病变。同时，应进行血吸附试验,应为阴性。（3）接种动物和鸡胚法检测病毒因子MCB或WCB细胞、增殖到或超过生产用体外细胞龄限制代次的细胞须采用动物体内接种法进行外源病毒因子检测。选用乳鼠、成鼠和鸡胚(两组不同日龄)共计4组，按表2所列方法进行试验和观察。接种细胞后，任何动物出现异常或疾病均应进行原因分析。观察到期时，应至少有80%以上接种动物或鸡胚健存，视为试验有效。接种动物未显示有外源病毒感染，则细胞判定为合格。表2动物体内接种法检测外源病毒因子动物组要求数量接种途径细胞浓度(个活细胞/ml)接种细胞液量(ml/只)观察天数结果判定乳鼠24小时内10(2窝)脑内腹腔＞1x1070.010.121应健存成鼠15~20g10脑内腹腔＞1x1070.030.521应健存鸡胚*9~11日龄10尿囊腔＞1x1070.23~4尿液血凝试验阴性鸡胚5~6日龄10卵黄囊＞1x1070.55应存活豚鼠350~500g5腹腔＞1x1075.042应健存，解剖无结核病变家兔1.5~2.5kg5皮下皮内**＞1x1079.00.1X1021无异常，健存*经尿囊腔接种的鸡胚，在观察末期，应用豚鼠和鸡红细胞混合悬液进行直接红细胞凝集试验。**每只家兔于皮内注射10处每处0.1ml对于新建细胞系/株，还应接种豚鼠和家兔（见表1）。豚鼠主要用于检查细胞内结核分支杆菌，在注射前观察4周，结核菌素试验为阴性者方可用于试验。家兔主要用于检测猴来源细胞中是否存在B病毒污染，也可用兔肾细胞培养法代替。（4）逆转录病毒及其他内源性病毒或病毒核酸的检测可采用下列方法对MCB或WCB细胞、增殖到或超过生产用体外细胞龄限制代次的细胞进行逆转录病毒的检测。①逆转录酶活性测定：采用敏感的方法,如产品增强的逆转录酶活性测定法(PERT)法或其他灵敏度相当的检测逆转录酶的方法检测细胞培养液上清中逆转录酶活性。②透射电镜检查：收集待检细胞，低速离心后，弃上清，沉淀中应含有1×107个细胞，且细胞存活率应不低于99%。在沉淀中加入固定剂，于4℃保存或直接包埋后制备超薄切片，置于铜网上染色后透射电镜观察。③感染性试验：将待检细胞感染逆转录病毒敏感细胞，培养后检测。根据待检细胞的种属来源，须使用不同的敏感细胞进行感染性试验。这三种方法具有不同的检测特性及灵敏度，因此应采用不同的方法联合检测。若逆转录酶活性检测阳性时，建议进行透射电镜检查及感染性试验，以确证是否有感染性逆转录病毒颗粒存在。小鼠来源和其他啮齿类来源的细胞系或其杂交瘤细胞系有可能携带潜在的逆转录病毒。因此，对于人-鼠杂交瘤细胞系则应进行特异性逆转录病毒检测。如用于单克隆抗体生产的小鼠细胞系，则可不检测特异性的逆转录病毒，但在生产工艺中应增加病毒灭活程序。（5）特殊外源病毒因子的检测应对MCB或WCB的细胞进行特殊病毒的检测。检测病毒的种类应根据细胞系/株种属、组织来源等确定。如鼠源的细胞系，可采用小鼠、大鼠和仓鼠抗体产生试验检测其种特异病毒。人源的细胞系/株，则应检测如人鼻咽癌病毒、人巨细胞病毒、人逆转录病毒、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒。在某些情况下，也可能进行转化病毒的检测，如人乳头瘤病毒、腺病毒及人单纯疱疹病毒。这些病毒的检测可采用适当的体外检测技术。5致瘤性检查某些传代细胞系已证明具有致瘤性，如来源于啮齿类的细胞系BHK21，CHO，C127细胞等，或细胞类型属致瘤性细胞，如杂交瘤细胞，则可不必作致瘤性检查。某些传代细胞系已证明在一定代次内不具有致癌性，而超过某代次则具有致瘤性，如VERO细胞，则必须进行致瘤性检查。人上皮细胞系、人二倍体细胞株及所有用于活病毒疫苗生产的细胞系/株应进行致瘤性检查。另外，新建细胞系/株必须进行致瘤性检查。在某些情况下，用于人体细胞治疗及基因治疗的细胞也须进行致瘤性检查。将MCB或WCB的细胞增殖到或超过生产用体外细胞龄