人类KRAS7种突变检测试剂盒(荧光PCR法)说明书-P4.2-12T-2015.10.09

版本号：P4.2生效日期：2015.09货号：ADx-KR011/2人类KRAS基因7种突变检测试剂盒（荧光PCR法）说明书【产品名称】通用名称：人类KRAS基因7种突变检测试剂盒（荧光PCR法）英文名称：HumanKRASGene7MutationsFluorescencePolymeraseChainReaction(PCR)DiagnosticKit【包装规格】12测试/盒【预期用途】KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。该基因的突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为15～30%，在结直肠癌患者中的突变率为20～50%。导致KRAS处于激活状态的突变主要位于第12和13密码子上。KRAS基因突变一般会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药，使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。但是，2010年10月的最新研究发现第13密码子上的Gly13Asp（G13D）突变亦对抗EGFR抗体类药物有治疗反应性（参见：DeRoock.W.JAMA.2010;304(16):1812-1820）。因此，KRAS基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。大部分肿瘤的突变都是体细胞突变，突变细胞往往与野生型细胞混杂在一起，因此所提取的DNA常带有大量野生型DNA，所以对体细胞突变检测需要较高的特异性，而目前广泛使用的直接测序法检测能力有限，不能完全满足临床需要。本试剂盒用于检测人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变（见表1），试剂盒以DNA为检测样本，提供突变状态的定性评估。辅助临床医生筛选出可受益于肿瘤靶向药物的大肠癌等癌症患者。该产品用于组织中提取DNA的KRAS基因7种突变的检测，为临床医生对大肠癌或肺癌患者选择肿瘤靶向药物治疗提供参考。表1人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变突变名称氨基酸变化碱基变化CosmicID公司命名Gly12Asp甘氨酸到天门冬氨酸GGTGAT52112-2-AGly12Ala甘氨酸到丙氨酸GGTGCT52212-2-CGly12Val甘氨酸到缬氨酸GGTGTT52012-2-TGly12Ser甘氨酸到丝氨酸GGTAGT51712-1-AGly12Arg甘氨酸到精氨酸GGTCGT51812-1-CGly12Cys甘氨酸到胱氨酸GGTTGT51612-1-TGly13Asp甘氨酸到天门冬氨酸GGCGAC53213-2-A【检测原理】本试剂盒基于实时PCR平台结合了特异引物和双环探针两种技术，检测DNA样品中含有的突变基因。利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，与此同时，利用双环探针对扩增产物进行检测，结合特别的PCR反应程序和高特异Taq酶的使用，在实时PCR平台上实现对样品DNA中突变的检测，以达到对稀有突变检测的高特异性和高灵敏度，即高的选择能力。【主要组成成份】试剂盒采用8联PCR管设计，每一个8联PCR管检测一个样品，8联管的1-7(或A-G，或8联PCR管两端各有一个小孔，小孔居侧端为1号管，小孔居中端为8号管)管内装有相应的KRAS基因7种突变检测和内控试剂，突变由FAM信号指示，内控由HEX（或VIC）信号指示；8（或H）号管作为DNA提取质量的外控检测管，亦由FAM信号指示，内控和外控作为对试剂、DNA质量以及操作本身的质控，选择的检测区域是人类KRAS基因相对保守的区段，约100bp，这样即便DNA有降解，外控和内控仍然能够最真实地反应KRAS基因有效的DNA量。每个PCR反应管内均含有5～10pM特异性引物、20pM双环探针、12.5μMdNTPs、175μM氯化镁、1mM硫酸铵、2.5mM氯化钾和纯化水等。（详见表2和表3）表2试剂盒组成试剂盒规格12测试8联PCR管反应条12条Taq酶（KRAS）35μLKRAS阳性质控品250μL表38联PCR管反应条的组成管号检测试剂体积荧光信号1A12-2-A35μLFAM，HEX/VIC2B12-2-C35μLFAM，HEX/VIC3C12-2-T35μLFAM，HEX/VIC4或D12-1-A35μLFAM，HEX/VIC5E12-1-C35μLFAM，HEX/VIC6F12-1-T35μLFAM，HEX/VIC7G13-2-A35μLFAM，HEX/VIC8H外控35μLFAM其它需要自备的试剂和耗材有：1.石蜡切片样品DNA提取试剂推荐选用厦门艾德生物公司的核酸提取试剂（型号：FFPEDNA，CatNO.ADx-FF01）；组织和胸水可使用厦门艾德生物公司的组织、胸水样品DNA分离试剂盒（CatNO.ADx-TI01）。2.无DNase和RNase移液器滤芯吸嘴。3.无DNase和RNase的纯化水。【储存条件及有效期】须避光储藏在-20±5℃。有效期为10个月。开瓶后使用不影响产品有效期。使用完毕后于-20±5℃保存。试剂盒在运输过程中，需要泡沫箱加冰袋密封运输，运输时间不超过一周，运输温度不高于室温。【适用仪器】StratageneMx3000P™/3005P™、ABI7900HT、ABI7500、ABIStepOnePlus、ABI7300、LightCycler480、Bio-RadCFX96。注意：①使用ABI仪器时探针模式设置，ReporterDye：FAM、VIC；QuencherDye：TAMRA；PassiveReference：NONE。②在ABI7900中，本试剂盒仅适用于ABI7900普通机型（非FAST机型），反应程序模式为标准模式，反应体积选择40µL，且需要PCR8联反应条辅助器（BIOplastics公司，Cat：7900RAN）。③适用于LightCycler480Ⅱ代仪器，若需在LightCycler480Ⅰ代仪器上使用，则必须进行荧光校正。若LightCycler480Ⅱ代仪器也出现荧光交叉现象，则也需要进行荧光校正，且需要PCR8联反应条辅助器（BIOplastics公司，Cat：B-79480）。④在使用StratageneMx3000P™/3005P™仪器时若发现荧光净升信号（dR）较低且本底荧光（R）非常高，应适当降低仪器的增益设置。⑤有关各仪器的具体设置方法可从厦门艾德生物医药科技股份有限公司网站资料下载区获得。⑥PCR仪器在使用过程中应至少每年校准一次。【样本要求】检测所用DNA的质量非常重要。由于肿瘤的复杂性，所采集的临床样品往往会混有正常组织细胞，不同类型样品正常细胞混杂程度不同，而且提取的DNA纯度和质量也因样品类型而改变，尤其是用福尔马林固定的石蜡切片样品，福尔马林会对DNA有交联和降解作用，因此请按下面推荐样品类型顺序收集样品并提取DNA用于检测，客户可根据临床实际样品的情况进行选择。1.推荐样品类型顺序：新鲜病变组织冰冻病理切片石蜡包埋病理组织或切片。2.推荐使用商业化的试剂盒来提取人类基因组DNA。所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度，其DNA的OD260/OD280在1.8～2.0。提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20℃以下保存，保存时间不要超过6个月。3.从新鲜病变组织中取样应确定至少含有30%肿瘤病变组织。4.石蜡包埋病理组织或切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，所取部分尽量在蜡块中部。5.所用石蜡包埋病理组织或切片样品一般请选择保存尚未超过3年的样品。【检验方法】建议在每次PCR反应中，每份样品和阳性质控品（STD）、阴性对照（NTC，自备纯化水）共同进行分析。1.取出KRAS阳性质控品和Taq酶（KRAS），阳性质控品先解冻，再振荡混匀。阳性质控品和Taq酶（KRAS）需快速离心15秒待用。2.分别向体积均为45μL的待测样品DNA、KRAS阳性质控品和纯化水（NTC）中加入2.25μLTaq酶（KRAS），涡旋器上混匀15秒，然后快速离心15秒。（1）根据样品来源不同，可将其分为石蜡切片样品和非石蜡切片样品。新鲜病变组织、冰冻病理切片等都属于非石蜡切片样品。（2）石蜡切片样品的DNA浓度推荐为1.5~3ng/μL，即每单个反应管添加的DNA量为7.5~15ng。根据石蜡切片样品保存的年限不同，建议：保存不超过三个月的石蜡切片样品每单个反应管添加的DNA浓度为1.5ng/µL；保存年限三个月至一年的石蜡切片样品每单个反应管添加的DNA浓度为2ng/µL；保存年限一年至三年的石蜡切片样品每单个反应管添加的DNA浓度为2.5~3ng/µL；不推荐使用保存超过三年的石蜡切片样品。（3）非石蜡切片样品的DNA浓度推荐为0.4~1ng/μL，即每单个反应管添加的DNA量为2~5ng。（4）稀释样品DNA时推荐使用TE（pH8.0）。稀释方法不推荐跨数量级稀释，即每次稀释倍数控制在10倍以内；稀释时取样量体积不宜小于5µL，以免稀释后终浓度与预算值有偏差。3.在PCR管冰架上，轻轻揭开8联PCR管反应条的条盖。如发现管盖内侧有液点，开盖前请先离心。4.将混好的DNA样品依次取5µL靠着PCR管上管壁加入8联PCR反应条中，然后小心盖上8联PCR管反应条管盖。注意：加好样品的PCR反应条应立即上机实验；若因特殊原因不能及时上机反应，应将PCR反应条置于冰水混合物上或4℃冰箱（温度恒定）保存，保存时间不宜超过12个小时。5.离心8联PCR管反应条。6.将8联PCR管反应条放入实时PCR仪器。PCR反应板布局见表4中推荐方法。7.打开仪器窗口，按照下图中说明的扩增程序图进行设置。第一阶段：95℃5分钟，1个循环；第二阶段：95℃25秒，64℃20秒，72℃20秒，15个循环；第三阶段：93℃25秒，60℃35秒，72℃20秒，31个循环；信号收集：第三阶段60℃时收集FAM和HEX（或VIC）信号，执行实时PCR，保存文件。8.实验结束后，使用2层PE手套包扎好PCR反应条（使用Mx3000P仪器时应该待热盖冷却后再处理，以免烫伤，同时可避免由于PCR管盖较热易开造成污染），并按生物垃圾处理。如非特殊需要，严禁打开PCR管盖，以防造成污染。【阳性判断值及检验结果的解释】1.阴性对照(NTC)的1-7（或A-G）号管的FAM信号应无曲线升起。若7管其中任一管FAM信号升起，则此次实验结果无效，同时建议重做一次。若1-7（或A-G）号管的HEX（或VIC）信号及8（或H）号管的FAM信号偶尔升起，此属正常现象，不影响对突变检测结果的判断。2.阳性质控品(STD)的Ct值一般小于20，但可能会由于不同仪器的不同阈值设置而发生波动。3.确定试验是否成功可信：（1）外控对照反应孔的FAM信号应该升起。若为石蜡切片样品，则其Ct值应在15～21之间；若为非石蜡切片样品，其Ct值应在13～19之间。（2）若能满足1）的要求，则继续进行分析。（3）如果其Ct值小于（1）规定的范围，说明加入的DNA过量，应减少DNA加入量再进行试验。但突变信号无升起或者落在阴性区，该试验结果仍然可信。（4）若外控对照分析为阴性或Ct值大于1）规定的范围，说明加入的DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量过少，需要重新提取DNA或增加DNA上样量再进行试验。但突变信号有升起且落在强阳区，该试验结果仍然可信。（5）待测样品的内控HEX（或VIC）信号应升起。若内控对照分析为阴性或部分管分析为阴性，说明加入的DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量不够，需要重新提取DNA后再进行试验。但如果管内FAM有信号，可能是由于突变序列的扩增抑制了内控序列的扩增，结果仍然可信。4.Ct值的确定：确认未选择校正荧光参照，按管号顺序依次选择单一检测表4PCR仪96孔板建议布局名称12„10111212-2-A样品1样品2„样品10STDNTC12-2-C样品1样品2„样品10STDNTC12-2-T样品1样品2„样品10STDNTC12-1-A样品1样品2„样品10STDNTC12-1-C样品1样品2„样品10STDNTC12-1-T样品1样品2„样品10STDNTC13-2-A样品1样品2„样品10ST