琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法

实验三琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法主讲教师和实验员：张运峰一实验目的学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法检测碱裂解法提取质粒的结果检测双酶切法鉴定重组质粒的结果（后续实验）检测PCR法鉴定质粒的结果（后续实验）二实验原理（1）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。（2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。琼脂糖是一种线性多糖聚合物。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。（3）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可判断DNA分子量大小和粗略估计样品DNA浓度。表1琼脂糖凝胶的浓度与DNA分子大小的关系三仪器、材料与试剂1.质粒样品、酶切样品和PCR样品。2.凝胶电泳系统和电泳图像分析系统(凝胶成像系统)等。3.琼脂糖、1XTAE电泳缓冲液、Goldview、6X载样缓冲液（6Xloadingbuffer）和DNA分子量标准（Marker）等。1.凝胶电泳系统DYY-6C型双稳定时电泳仪电源（北京六一）输出范围（显示分辨率）：6-600V(1V)4-400mA(1mA)240W美国Bio-rad伯乐小型水平电泳槽Mini-SubCellGTCell2.凝胶成像分析系统3.Marker一个已知分子质量的DNA样品做最对照，用来确定待测样品的相对分子质量。4.常用电泳缓冲液缓冲液缓冲容量迁移速度分辨率用途TAE最低最快(高10％)高分子量高高度复杂DNA混合物；超螺旋DNATBE很高较慢低分子量高价格昂贵，不常用TPE电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。5.上样缓冲液4.常用核酸染料名称优点缺点EB（溴化乙锭）染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。Gldview低毒，灵敏度较高的染料；可以加入样品中。dsDNA呈现绿色荧光,而ssDNA呈红色荧光,能较好地区分dsDNA与ssDNA。价格稍高，灵敏度较低。背景强烈。SYBR新型低毒，高灵敏度染料，可以加入样品中。价格昂贵。对小于50bp染色缺失，小于100的染色效果较差。稳定性差Genefinder花青类染料,毒性很低；最大吸收峰为470nm。具有安全、灵敏、经济的特点重复性较差。能引起有机体突变。溴化乙锭溴化乙锭（3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐EB），EB染色（EB可很好地掺入到双链DNA中），在紫外光下会发出橙红色的荧光，用于对DNA进行染色和观察。用于观察的紫外光有３种波长，一般使用中波紫外光（302nm）。短波紫外光（254nm）观察效果较好，但对DNA的破环很大。长波紫外光（366nm）：回收。1.制备琼脂糖凝胶（1%）2.制备凝胶板3.加样4.电泳5.染色6.结果观察四.实验步骤1.制备凝胶和胶板：20ml(1×TAE)+0.2g琼脂糖（三角瓶），煮胶，溶解，冷却至60℃(不烫手)，倒板，室温下充分凝固，竖直拔下梳子。胶板设计（27人）：•每11孔胶板（4人：2样品+1marker）。5μl质粒DNA+1μlloadingbuffer混匀；15μlPCR产物+3μlloadingbuffer，混匀；10μl酶切产物+2μlload-ingbuffer混匀；5μlDNAMarker(每板胶一孔）2.加样3.电泳电压3-5V/cm，约80-90V，注意电极方向4.观察紫外透射分析仪下观察。六实验结果琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。琼脂糖凝胶结构形成过程琼脂糖单糖分子结构琼脂糖粉形成琼脂糖凝胶的过程DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开，此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。核酸分子大小及琼脂糖的浓度的关系