实用流式细胞技术及其样品处理

实用流式细胞技术及其样品处理FACSAria(FACSDiva)流式细胞术基本原理在不同领域的应用样品及其前处理一、流式细胞术基本原理OrangeTimeTimeTimeTimeFSCGreenSSCTimeRedGreenDataProcessorSSCFSCOrange最大特点：单细胞水平的分析BlockingcapillaryDetector单细胞液流柱的形成InjectorTipSheathfluidSheathfluid利用流式细胞术可以获得哪些信息细胞的相对计数、绝对计数细胞成分的相对定量、绝对定量单参数或多参数细胞表面、细胞内成分可溶性成分流式分子表型流式细胞术可以产生哪些信号细胞的物理参数：散射光细胞的理化参数：荧光散射光信号FSCSensorLaserSSCSensor前向角散射（FSC）：与球形细胞直径的平方密切相关。侧向角散射（SSC）：对细胞膜、细胞质的折射率敏感。对细胞质内较大的颗粒也有反映。用来获取有关细胞内部精细结构和颗粒性质的有关信息。neutrophilsbasophilseosinophilsmonocyteslymphocytesneutrophilsmonocyteslymphocytesLaserFSCSSCMonocyteLymphocyteGranulocyteFSCSSC荧光信号LaserFSCSensorFluorescencedetector单个细胞的总荧光强度单标样品Laserlogfluorescenceintensitycellnumber42%positiveAntigenA58%negativeAntigenAFL2FSC双标样品LaserLogfluorescence(green)Logfluorescence(red)A+(%)B+(%)A+B+(%)neg.(%)FSCFL1FL2HistogramDotPlotContourPlotPseudo3-dimensionPlot3-dimensionPlotUnimodalorbimodal道数（channel）荧光强度坐标不等距“Particle”canbeusedasamoregeneraltermforanyoftheobjectsflowingthroughaflowcytometer.“Event”isanythingthathasbeeninterpretedbytheinstrument,tobeasingleparticle,correctlyorincorrectly.Eachmeasurementfromeachdetectorisreferredtoasa“parameter”.Dataarestoredinso-calledflowcytometrystandard(FCS)format.Datastoredononecytometermaynotbeanalyzableonsoftwarefromanothercytometer.细胞分选分选纯度分选产率厂家、型号、激光器、滤光片、软件BectonDickinson(MaxwellW.BectonandFairleighS.DickinsonBD)：FACS“FluorescenceActivatedCellSorter”FACSI,II,III,IV,400,420,440,FACStar,Vantage,DiVa,Aria:Sorters.FACSAnalyser,can,Calibur*,LSR,Canto:‘Benchtop’.Coulter(BeckmanCoulter)：EPICS“ElectronicProgrammableIndividualCellSorter”Profile,Elite,XL,ALTRA:amixtureofsortersand‘benchtops’.OtherManufacturers:Partec,Ortho(Cytofluorograph,Cytoron),Skatron,Partec,Dako(Galaxy),Cytomation(MoFlo).July2002:DakoCytomation:Cyanbenchtop.460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50LongpassShortpassBandpass滤光片二、在不同领域的应用细胞周期分析细胞功能分析细胞凋亡分析免疫学领域其他领域（一）细胞周期分析G0/G1SG2/MPI#ofEvents02004006008001000PIAneuploidpeakDNAindex1.21CellularDNAcontent必须用RNase去除RNADNA合成---BrdUIncorporation凋亡细胞BrdU+或S期细胞G0/G1期细胞G2/M期细胞增殖细胞核抗原（Proliferatingcellnuclearantigen，PCNA）:参与DNA复制和核酸的切补修复（excisionrepair）的一种蛋白增殖相关抗原（proliferationrelatedantigen）：Ki-67，Ki-S1细胞周期蛋白：CyclinD1,E,A,B1（二）细胞功能分析细胞活性分析细胞膜电位线粒体膜电位、膜蛋白抗原7A6细胞内Ca2+胞浆内pH活性氧（ROS）1、细胞活性分析根据对细胞膜的渗透性不同来区分活/死/凋亡细胞：PI，EB，7-AADandHoechst333422、细胞膜电位由于细胞膜上各种泵的作用，如钠钾泵、钙泵等，使细胞膜内外维持着不同离子的浓度梯度，造成细胞膜电位3、线粒体膜电位（MMP）线粒体在呼吸氧化过程中，将所产生的能量以电化学位能储存于线粒体内膜。JC-1可进入细胞内，特异地与线粒体内膜结合，其聚集程度随MMP升高而增加。绿光，monomer形式存在膜电位下降（＜100mV）时橘红色，J-aggregates形式存在膜电位升高4、线粒体膜蛋白抗原7A6（38kDa）凋亡早期的反应，早于形态学、光学特征变化及台盼蓝染色5、细胞内Ca2+浓度上升，与两种情况有关。一是与细胞活化，二是细胞膜完整性遭到破坏，可作为细胞凋亡或坏死的标志。6、胞浆内pH活细胞内pH变化范围较小。某些生物学过程，如细胞分裂及对细胞信号的应答，会出现pHi的变化。增殖细胞比静止期细胞偏碱性。7、活性氧（ROS）参与细胞生长、发育、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。DCFH-DA本身没有荧光，在细胞内转化成DCFH。在ROS作用下，氧化为绿色荧光物质DCF。其荧光强度与细胞内ROS水平成正比。（三）细胞凋亡分析1、散射光信号的变化2.DNA含量PI-Fluorescence#EventsApoptoticcellsNormalG0/G1cells3、磷脂酰丝氨酸外翻（Phospholipidredistribution）4、Caspases-3的激活凋亡晚期，核酸内切酶活化，双链DNA会出现许多不对称断裂点，产生一系列的3’末端。TdT酶能够催化外源性荧光素-dUTP连接到DNA的3’末端。尽管坏死细胞的细胞核DNA也在降解，末端也增多。但这种随机的降解所产生的末端较难与荧光素-dUTP结合。因而，坏死的细胞进行TUNEL反应观察不到荧光。5.TUNEL6.p5353kDa的核内磷蛋白，在细胞周期中，控制着细胞在DNA损伤无法修复时启动细胞的“自杀”过程。P53突变或缺失是多种肿瘤发生的重要原因。（四）在免疫学领域的应用NK细胞中有CD8+细胞;少量的单核细胞也能表达CD4;结合淋巴细胞绝对数来看待某一亚群百分比的改变。WBC（CD45+）CD3+TlymphocyteCD19+BlymphocyteCD16+56+NKThelper/Tinducer（CD3+CD4+）Tsuppressor（CD28-）CD8+TTcytotoxic（CD28+）1、淋巴细胞亚群分析评价机体的免疫状态：自身免疫、免疫缺陷等68%CD8dim3.6%CD8dim10%6.7%Naïve/MemoryTlymphocyte刚从胸腺移出到外周循环的Naive细胞，首次遇到抗原时，增殖反应强，产生细胞因子能力弱。当Memory细胞遇到同类抗原时，产生大量的细胞因子，而不是增殖反应。NaiveT细胞高表达CD45RAhi、CD62Lhi。MemoryT细胞表达CD45RO，一般不表达CD45RA从Naive向Memory细胞转化过程中，CD11a表达增加、CD62L（L-selectin）表达丢失。Th1/Th2lymphocyteT细胞根据其分泌的细胞因子分为两型。Th1类细胞分泌IL-2,IFN-γ和TNF-α，参与细胞免疫，对抗胞内病原体，如病毒；Th2类细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10与IL-13,参与体液免疫，对抗胞外感染，如寄生虫。Mousechicken（42d）chicken（42d）2、细胞表面活化抗原的表达3、细胞因子分析CBA（CytometricBeadsAssay）分析液体样本中可溶性成分用一系列荧光强度不同的微球同时分析样本中多种可溶性成分。每种微球大小一致，分别包被有适合于特定分析的特异性抗体。所有分析只需一组标准曲线，检测的线性范围宽（0--5000pg/ml）captureAbFluroescentdetectionAbScattergateonsingletsR1IL2IL4IL5IL10TNFαIFNγIndexBeadsinFL3-ReadsignalsinFL20208031362512505000standardcurvesgeneratedbyCBASoftwareHumanTh1/Th2CytokineCBA110100100010000110100100011010010001101001000110100100011010010001101001000100001010010000pg0pg0pg0pg0pg20pg80pg312pg1250pg5000pg40pg156pg625pg2500pgIL-2IL-4IL-5IL-10TNF-aIFN-g细胞膜表面的细胞因子分析将细胞表达的细胞因子阻断在细胞内CESEstainingcellprotein4、细胞分裂PKHlipophilic(亲脂性)dyethatinsertsintothelipidbilayeroftheoutermembrane.通过分析，可以计算分化前体频率（precursorfrequency）评价细胞杀伤过程的生物学变化：如效应细胞的凋亡，CTL介导的裂解功能的抑制。5、CTL功能分析FluorogenicCaspaseSubstrates检测CTL介导的靶细胞凋亡proteolyticcleavagesitesforindividualcaspases18-amino-acidpeptidesfluorophoreIntheuncleavedsubstrates,fluorescenceisquenchedowingtotheformationofintramolecularexcitonicdimers.Oncleavageofthepeptidesbyspecificcaspases,thefluorophore–fluorophoreinteractionisabolished,leadingtoanincreaseinfluoresence.TargetCelleffectorcellsSpecifickilling只要合成各种特异性抗原，即可定量体内抗原特异性CTL。6、抗原特异性T淋巴细胞的分析其他领域的应用具有细胞壁的细胞及其细胞壁的主要成分：植物细胞（纤维素）、细菌（肽聚糖）、真菌（几丁质）细菌的大小、质量、核苷酸和蛋白含量等大约是哺乳动物细胞的1/1000。信号强度低，限制了检测的精确度。细菌吸收和排除染料、药物等受细胞壁结构和孔、泵的影响。肽聚糖外膜G+G﹣肽聚糖细