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1基因表达量实时荧光定量PCR检测步骤1材料(试剂和耗材)1.1样本(小鼠组织)-2个1.2引物(lifetechnology公司合成)1.3BestarTMqPCRRTKit(德国DBI货号:DBI-2220)1.4Bestar®SybrGreenqPCRmastermix(德国DBI货号:DBI-2043)1.596孔板(美国lifetechnology)2材料(仪器)2.1ABI7500荧光定量PCR仪(lifetechnology公司)2.2TGL-16M低温冷冻离心机(湘仪)2.3SW-CJ-1D单人净化工作台(泸净净化)2.4HR40-ⅡA2生物安全柜(Haier)3实验步骤3.1RNA的抽提RNA的提取按lifetechnology公司提供的TriozolRNA提取试剂盒的使用说明进行。程序如下:(1)将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1mlTRIzol;(2)加入0.2mL氯仿,盖紧离心管管盖,上下颠倒混匀60s(请勿涡漩激烈振荡),室温静置3min,12,000g,4℃离心15min,置于冰上;(3)溶液分为三层,RNA溶解在水相中,小心吸取500μl水相至另一个新的RNasefree的EP管中;(4)加入500μl异丙醇,-20度放置1h,12,000g,4℃离心10min,离心后管底出现RNA沉淀,弃上清;2(5)加入1ml75%乙醇,用手轻轻颠倒,12,000g离心5min,去上清;(6)超净工作台上吹干样品10min,加入适量DEPC水溶解RNA。加入40μlDEPC水溶解沉淀。3.2RNA质量检测紫外分光光度计测定RNA浓度:sampleIDconcentration(ng/μL)260/280a9981.87b10241.973.3去基因组DNA和cDNA的合成将RNA加入到gDNA吸附柱,室温10,000g离心1min,收集滤液即为去除基因组DNA的RNA。把RNA在65°C条件下热变性5分钟后,立即置于冰上冷却。逆转录反应:5×RTBuffer2μLRTEnzymeMix0.5μLPrimerMix0.5μLRNA6μLRNase-freeWater1μLToal10μL反应条件:37°C,15min98°C,5min4°C,hold反应结束后,-20°C保存。33.4cDNA的实时荧光定量PCR3.4.1实验步骤每个样本分别设置3个目的基因和3个内参基因的平行实验。PCR反应体系为20μL,根据表1.配置。反应条件为:95°C2min95°C10s60°C34s(采集荧光信号)72°C30s循环结束后从60℃升高到98℃获取熔解曲线。表120μl荧光定量PCR反应体系试剂体积(μL)终浓度灭菌蒸馏水4.46/Bestar®SybrGreenqPCRmastermix101×ForwardPrimer(20μM)0.250.25μMReversePrimer(20μM)0.250.25μM50×ROX0.040.1×模板5/Total20/表2使用的引物基因名称GenebankID引物序列扩增长度(bp)Mus-GAPDHNM_001289726.1Forward:TCCACTCACGGCAAATTCAAC146Reverse:GTAGACTCCACGACATACTCAGCxNM_*****Forward:Reverse:yNM_*****Forward:Reverse:3.4.2实验结果的分析方法本实验采用2-△△Ct法进行分析,计算公式为:)]平均Ct值对照组管家基因-平均Ct值对照组目的基因(-)平均Ct值基因待测组-平均Ct值待测组目的基因[(管家2FF为相对表达量,根据此次试验的设计,对照组中的目的基因表达量为1。45个循环44结果4.1扩增曲线GAPDH基因扩增曲线x基因扩增曲线y基因扩增曲线54.2熔解曲线GAPDH基因熔解曲线x基因熔解曲线y基因熔解曲线-24.3实验数据见EXCEL表格。备注:Ct目的基因Ct管家基因Ct;Ct待测样品Ct对照样品Ct;Ct相对表达量。4.4柱形图0.000.501.001.502.002.50G对BG3Bx2^(-△△Ct)6广州辉骏生物科技有限公司0.000.200.400.600.801.001.20G对BG1By2^(-△△Ct)
本文标题:基因表达量实时荧光定量PCR检测步骤
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