qRT-PCR技术

qRT-PCR逆转录定量PCR（qRT-PCR），是一种应用广泛的研究基因表达模式的方法，尤其是在样品量少或者说非常珍贵的时候。这种方法主要的优点是范围宽、敏感性高、精确度高，无PCR后处理步骤，避免了交叉污染，且产出率高，可以进行多重检测等。技术方法简介所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。RT-qPCR实验步骤反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;扩增:用PCR的方法扩增cDNA;检测:实时检测和定量扩增的产物.RT-qRCR影响分析可靠性关键点:分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计;反转录反应的非标准化影响试验的稳定性;数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果;因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，但下列因素是值得注意的事项:新鲜、冰冻、甲醛固定的样品的RNA提取方法有所差别;整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞的处理差别;总RNA或者mRNA样本的预处理;注意RNA反转录成cDNA的不同的策略;注意不同的酶以及酶的缓冲液的不同组合;注意qPCR仪器参数的变异系数、灵敏度;注意qPCR仪器的多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式;注意每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。RNA质量评价:从胶版图可以清晰地看到三带,如图引物设计简介:DNA引物长度:15-25个碱基;GC含量:50%左右如果引物的与AT区域富集结合,可以考虑用LNA替换几个碱基,较少引物的长度以及避免引物次级结构和3’端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争,分之内杂交,倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达到降低,因此我们选择引物二聚体的△G为负值,即:10kcal/mol.没有连续的G/C。引物设计注意事项:检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计。在靶序列中避免直接待重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性结合，降低DNA的扩增效率以及减少分析的灵敏度。考虑到潜在的剪接变异体以及合适的所需要的获得到靶，通过生物信息学分析内含子以及外显子的边界，主要通过cDNA和基因组序列比对来确定。一般都设计跨最长内含子区，这样减少了扩增子受到基因组DNA的污染的影响。这是十分有必要的，特别当用基因组DNA做归一化处理以及靶向某一特异的剪接变异体。最经济的做法是让下游引物跨越剪接接头，这样允许使用一条探针检测可能剪接变异体.然后如果在有效性和灵敏度无法保证情况下，可以使用跨越单一外显子的设计方案。我们还是建议试验者用DnaseI处理样品，除去gDNA的污染。在RT步骤时，用生物信息分析工具检测在特定温度下靶序列的折叠情况，避免一些高度次级结构的区域，那些区域探针和引物结合效率较低7。尽可能用60-150bp的扩增产物，GC含量在60％或者稍小来确定高效的变性，更高度反应效率。GC含量高度序列容易产生非特异性的反应，短序列扩增是的扩增时间缩短gDNA污染可能性减少。短的序列容易人工合成，用来做扩增多标准曲线。用oligodT进行逆转录最好设计扩增子位于靠近模板的3’区域。