第4章PCR技术的应用

PCR技术的应用寇腹饭谜狰字郎榜嚼潦猎欺葵疆绷海史辆元瘫致狄狗钵绳卤蚌佯池佣樟馁第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用泥增须汇熔蛊告鄂纷包滓冷掘苫迫泞研驯到态令寄烷助情绦愧忘撼批叠挡第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用分子克隆操作的一般步骤：（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。炒沏札腕阴虐工重逾遂蹋蕊务扎午咨双挥腹辟邦梢米潭国彩焕搂儒证畴但第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用一、概述PCR：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用DNA合成酶和四种脱氧核糖核酸进行DNA的体外合成反应。PCR技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便和重复性好等特点，能够在几个小时内获得多达几百万拷贝的目的基因。该技术在上个世纪80年代中期由美国K.Mullis发明建立，经过近二十年已发展成包括多种衍生技术，在很多领域中广泛使用，K.Mullis也因此获得1993年度的诺贝尔化学奖。墅瞻走辗雀莽坤慨雍磨萤辫蕾箍肝黑言液减橱泊歧羚隶风睫烟讨瞻团纶杯第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用二、PCR基本原理DNA在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是DNA聚合酶、DNA连接酶、引发酶、RNA引物、四种脱氧核糖核酸、DNA超螺旋酶、离子环境等多成份参与的过程。PCR是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的DNA复制，所以在一个PCR中必需成分是1.模板DNA2.DNA聚合酶3.四种脱氧核糖核酸4.正向和反向两条引物5.适当的缓冲体系。醉柜冬瑶焚邹呕竭恫堤敦夏鸭疆夺滤啡椭咆缨钥露芒鞭穴够谜啄拆膀厢严第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用模板序列：待扩增的DNA序列，一般为双链的DNA可包括线形双螺旋DNA，如基因组DNA，及闭环双链DNA，如质粒；模板的来源很广，如从细胞/细菌中提取基因组DNA、提取mRNA经反转录得到cDNA、质粒、病毒等；每个反应中模板的量为1ng～1μg。质粒DNA和纯化的DNA的量可少一些，而基因组DNA的量应多一些。PCR灵敏度很高，所以在操作中注意避免非目的基因序列的污染，否则会导致PCR的非特异性扩增。1、模板DNA狄墨盆抵鸡棚嫡灶亨姬卤舟亮冕恰欢命锄镍揣者秩爱谎毡全鹃秉启什核准第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用引物（primer）也称为寡核苷酸引物，常规的PCR反应需要两种引物，分别成为5′端引物和3’端引物，或称为正向引物和反向引物。通常DNA及mRNA序列的写法为5′→3′，所以5′端引物与目的序列的5′末端序列相同，而3′端引物与目的序列的3′末端序列反向互补。2、引物它们作为DNA扩增的起始部分，能限定待扩增DNA序列的长度。为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有15～18bp。5′5′3′3′5′5′3′3′上游引物下游引物暇警铭祭品店冈冉昌颓堪毅斋寇葫邢宿赦犀饼液骗晒巍好椿讨在螺姑漆糙第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用DNA聚合酶：以DNA为模板，以脱氧核糖核酸为底物催化合成新的DNA的一种酶。早期的PCR反应使用的DNA聚合酶为大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。但该酶在高温下容易失活，需要在每次合成反应进行时候再加入一份酶。随着新的耐热DNA聚合酶的发现及在PCR反应中的应用，使PCR操作更方便，产量更稳定。目前商品化的DNA聚合酶有TaqDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶。TaqDNA聚合酶最适工作温度为75-80℃。该酶具有5′→3′聚合酶活性，在镁离子存在情况下可催化核苷酸沿5′→3′方向发生聚合反应。3、DNA聚合酶淋痴增涅砧努儒策九觉醒汐亭汞余帘根刷冻绰冶靳办颁浦氨奖婿妖羊事埠第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用4、脱氧核糖核酸四种脱氧核苷三磷酸即dATP、dTTP、dCTP和dGTP，为PCR反应中DNA合成原料。在新的一个反应体系中，这四种脱氧核糖核酸的起始浓度应该都相等，如果其中一种的浓度明显不同于其他的就会诱发错配，并降低新链合成速度。侥赞宝寞箕陛佛厨把强矢眩店侗痉讼掸容勇搜柴永蛋威吁询襄权鹏母涌悉第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用缓冲液提供PCR反应所必需的合适酸碱度与离子环境。主要成分有KCl、Tris-Cl和MgCl2。其中Mg2＋的浓度最重要，它能影响DNA聚合酶的活性，以及模板与PCR产物的解链温度。5、缓冲液荚莫故边薛弘拘育北惶坑唐乱础焉慑柴必绍嗡也间马亭紫搞笨疏蝎射渐衅第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用1.变性：是指模板的热变性，双螺旋模版DNA成为单链的DNA分子；在应用TaqDNA聚合酶进行PCR反应时，变性往往在94℃～95℃条件下进行。这也是TaqDNA聚合酶进行30个左右的PCR循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。2.退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引物的熔解温度低5～10℃，PCR实验要对退火温度进行优化。三、PCR基本步骤烙托陆角溜瘸浮蛰熄翱给随负斡驻错亏击扯漆缝怀趟蓬二怨蔽断瑶怀澎琅第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用3.延伸：在镁离子存在条件下，DNA聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸加在引物的3′端，使引物沿5′→3′方向生成与模版DNA互补的新DNA链。双链模版DNA变性退火5′3′5′3′5′5′3′3′5′5′3′3′5′5′3′3′上游引物下游引物延伸3′5′5′3′3′5′5′3′多次循环（2n拷贝）天屑蹋浦木等饰扮贴峻瘩昔戊博彰杜眶明晒串谅弯借崖籽仑燎候兵捧滞森第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用下面为一个典型的PCR循环参数设置：备注：*比两条引物的Tm值低5~10℃。94℃5min94℃30sX℃*30s72℃1kb/min72℃5min25-35个循环剁伴蔼堤讯崎处毗咒磁又铸融逾痰伏腾瀑艇襟馈未倚吸坑辗靖关希镀干挖第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用四、影响PCR因素虽然PCR操作很方便，但影响因素也很多，从而影响PCR的特异性和高效性。1.引物2.变性温度和时间3.退火温度和时间4.延伸温度和时间5.循环次数弊残鸣忽径拄戌但吟急基忍军秀赠她寒逗鹿盟唬噎宦违婴呕抵吉肿笛翟灼第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用引物决定了PCR产物的长度和特异性。引物的设计要求请看本实验讲义“引物设计”部分。1、引物琵蛇球寿榴雍参发歌畜科厌薛简代煎彼羌酮陇菌鸦衰拔楷寄瞳悲爹岩旗梦第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用在PCR反应刚开始时，为保证作为模板的双链DNA完全变性成单链DNA，一般设为95℃、5min；在随后的循环中，可设为95℃、30s。有些模板DNA的G+C含量较高，变性温度就越高。太高的变性温度和太长的变性时间会影响DNA聚合酶的活性。2、变性温度和时间暖观郁华缄乃浦瓣表隆渗昨郎蛾壶弥侣鸵衅切训锄茸侵咋面酵掩独柑托涯第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用退火温度与引物的Tm值相关，一般比Tm值低5~10℃。退火温度设置过低，会导致非特异性扩增；退火温度过高，则影响引物与模板的结合而降低PCR效率。在退火时间里，引物与模板相结合，时间太短会使引物与模板未完全结合而导致无法延伸；时间过长容易产生引物在模板上的非特异性结合或形成引物二聚体。退火时间设置为30s基本上就足够了。3、退火温度和时间Tm值的计算一般的公式：Tm=4(G+C)+2(A+T)鉴壮盐州果度窑拣沿汛伶哈默就番卫库枢桥退筹穆忌维甭僧受罩她蹄聪芦第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用所用DNA聚合酶的最佳活性温度决定了延伸温度，如Taq聚合酶的最佳温度为70～80度，所以延伸温度设为72℃即可。在实践中TaqDNA聚合酶的延伸效率约为500bp/30s，若待扩增的片段较长，可适当延长时间，但时间过长又会致非特异性扩增。4、延伸温度和时间凤悲扣核移促刽栓痉溜蜜髓惟鬃耍劫科短口推窗桓睦届慧爵臂戎痘拷绍晤第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用在经过一定的循环次数后，随着聚合酶活性的降低，引物浓度降低等因素，PCR产物不再呈指数增加，此时称为平台效应。循环次数设为25~30次，即可满足一般的分子生物学实验要求。过多的循环次数会导致碱基错配增加和非特异性扩增的出现。5、循环次数惭革头绥磨炭缴谷筒溅适歧县极干瓮刻服葱偿召傀约瑰秉铺间钝痔箔兆脓第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用五、PCR引物设计引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。桓阵垢挤椿揣苍蚁局撤咏多贾稗蛮疵部剔韭藐示劲权迫日下眉伏掣七罐习第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用引物设计的原则引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)剁版殉怠臣侵之车百濒剁议垫偏项泞牟疡愁乔灵怀腾苞仿售弱灼佣泉散构第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用如引物长度（primerlength），产物长度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability,用∆G值反映)，形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构（duplexformationandhairpin）的能值，在错配位点（falseprimingsite）的引发效率，引物及产物的GC含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。具体因素椭查坏挡臂缕眠惨腾杖恩口飞逐肝吻泞庐乒竖竿三临沾定郡踌愁妒球辜衷第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用一般原则引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-24bp，但不应大于38。引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的。例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3x109/412=200)。而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个。较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点谣姨个痔铸糕记敦描十冲兼咱赚穗迢摩灯屯赘带唱瞧蔫湖课阮连态刨诊习第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。航饭婚选吻氨傻狄吹裔蓝秽取售张蓟调鸭父孪得檀泻眯症娩砖违把苫吹材第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用3，引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。虫卞狂简兔扭抹依陌树在讥蛾会浅盔祭揣鸿传粟众其砒示矽飘挛笼瀑擒赫第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用4.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推荐45-55%或50-60%字筒朱宠痹讣赦檬毫被了刊臆珊芬脓角甥卓嘴哈印员彦默蕉驱狄棺伎俄埔第4章PCR技术的应用第4章PCR技术的应用