sgRNA设计

SgRNA设计方法SgRNA（smallguideRNA简称），是CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部分，早先发现的guideRNA，由两部分组成—tracRNA和crRNA,两部分融合表达后，即sgRNA也能很好的行使guide的功能，与cas9蛋白结合，引导cas9酶靶向基因组DNA进行剪切。SgRNA脱靶问题一直备受关注，如何设计特异性好的靶点成为大家关注的焦点，很多实验室开发了不同的设计软件，大体原则如下：（1）对于sgRNA的长度，一般应为20nt左右；（2）对于sgRNA序列的碱基组成，可选3'末端含GG的sgRNA，同时sgRNA种子序列尽量避免以4个以上的T结尾，GC%含量最佳为40%~60%；（3）sgRNA的种子序列与脱靶位点的匹配数尽可能低（4）如果构建U6或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需考虑sgRNA的5'碱基为G或GG，以提高其转录效率；（5）对于sgRNA靶向基因的结合位置，如需造成基因移码突变，需尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子；（6）检查sgRNA靶向结合位点基因组序列是否存在SNPs；（7）如采用Cas9单切口酶，设计paired-gRNA需考虑成对sgRNA的间距；（8）全基因脱靶效应分析，需考虑脱靶位点最大允许几个错配碱基数，建议最少5个碱基。重点考察种子序列和非种子序列碱基错配数，以及脱靶位点是否位于基因编码区等，另外还可考察是否存在碱基插入或缺失的脱靶位点。另外SgRNA的活性与CRISPR系统的突变效率直接相关，好的sgRNA靶点，会带来更高的突变效率，更多的阳性克隆，在后期筛选和鉴定时都能事半功倍，所以在着手进行基因编辑前，设计并找到有活性的靶点至关重要。通常在设计特异性靶点后，需要进行体外细胞活性筛选，筛选出有效的靶点用于后续实验。如何设计特异性好的sgRNA:1、如果软件中有你需要的物种基因组序列，可以在下列网站中设计。1、、、~slin/cas9.html4、、、、、、、、、植物SgRNA设计靶序列选择：根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中（），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列。根据设计的sgRNA靶点序列，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG合成一对序列互补的DNAOligos。根据酶切方式，选择合适接头，例如，PX458等质粒sgRNA靶点oligo如下（BbsI酶切）：5‘-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3‘-CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-CAAA-5’测序引物：U6-CRISP/Cas9-promoter：gggcctatttcccatgattc根据需要，设计好的靶点可以用于载体构建，或体外转录sgRNA，进行细胞转染或受精卵注射。吉荧生物产品和服务1、cas9mRNA、sgRNA体外转录产品，cas9蛋白。2、cas9质粒载体，sgRNA设计，活性筛选服务3、优势服务：干细胞基因敲除、大片段删除4、Cas9病毒载体，病毒包装、cas9稳定株构建服务5、斑马鱼、鼠基因敲除6、miRNA原位杂交探针更多资料请见：1487298091基因功能研究-吉荧生物