3T3-L1细胞实验操作

3T3-L1细胞实验操作3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞（前脂肪）培养基配制（准备1L高压过的超纯水）1、DMEM粉倒入1L放旋子的烧杯，加灭菌水1000ml，盖锡纸磁力搅拌40分钟。2、擦净，加入3.7gNa2CO3，盖锡纸磁力搅拌10分钟。3、称2.38gHEPES（4℃保存），盖锡纸磁力搅拌20分钟。4、拿过滤嘴、针筒，用针筒吸配好的培养基，通过滤嘴过滤至高压过的100ml瓶分装，4℃保存，用时加10ml血清配成10%FBS。顺便先配诱导液：配好的培养基分装入100ml瓶中，90mlDMEM。准备好FBS、IBMX、DEX、insulin（2μg/ml）先配两瓶100ml10%FBS，A液：IBMX1ml+DEX100μl+insulin250μl入100ml10%FBSB液：insulin250μl入100ml10%FBS（先过滤）细胞冻存（全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）1、准备DMEM（分装好的）*1瓶，50ml瓶*2，针，过滤器*1，DMSO试剂，冻存管。2、配冻存液（10ml）：按5：4：1比例→培养基5ml：血清4ml：DMSO1ml，混匀。3、拿出一个新的、标记好用针筒把过滤器弄在瓶口用针筒吸新配的冻存液，把针头摘掉，经过滤器把新配的冻存液滤到新瓶。4、PBS清洗细胞，加完盖盖子，加在壁上，然后吸弃，换枪头吸（一对一）。5、吸胰酶500μl（吸匀再用），放显微镜观察，消化完毕即吸弃（一对一）。6、大皿加入2~3ml冻存液，打圈吹散，分装1ml至冻存管，勿离心。7、-4℃30min，-20℃1h，-80℃2h，最后液氮冻存。一、细胞复苏（准备10%FBS、晚上复苏）1、将从液氮取出冻存管放入37℃恒温水箱搅拌解冻。2、将细胞悬液软管吸取至培养皿中，加入5~6ml10%FBS，混匀。3、培养过夜后进行换液。二、细胞传代（全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）10%FBS即90mlDMEM+10ml血清半个月内用完1、缓慢吸走旧培养基，换枪头，用2mlDMEM清洗，后吸弃。2、加500μl胰酶，在显微镜观察细胞形态，大部分消化成方形即可吸弃胰酶。3、加入2ml10%FBS，打圈混匀，吸1ml，每皿大概5~6滴入新的培养皿（大皿10滴~1ml），其余弃掉，后加3ml10%FBS（大皿8ml），大概可2天传代。4、换液时需缓慢吸弃旧培养基，DMEM清洗细胞（注意换枪头杜绝污染）后吸弃，10%FBS贴壁加入3ml。三、细胞接板（全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）24孔板：560μl细胞+6ml10%FBS（12个样）【600μl分化1.2ml增殖】12孔板：1400μl细胞+11ml10%FBS用25ml瓶一板对一瓶装1、准备好12孔板、24孔板各两份（两皿细胞）、DMEM、血清、25ml瓶4个、软管。2、配10%FBS90mlDMEM+10ml血清3、第一二瓶各6ml10%FBS，第三四瓶各11ml10%FBS4、吸弃旧培养基，加2mlDMEM摇晃清洗，吸弃，500μl一皿细胞胰酶消化，显微镜观察细胞分散开来即停止消化。5、每皿加入2ml10%FBS，1ml枪头打圈吹散。6、将两皿细胞集中在一个培养皿，打圈吹散。7、560μl细胞分别加入一二瓶混匀，1400μl细胞分别加入三四瓶混匀。8、一二瓶对应加500μl细胞进24孔板（加12个孔）摇晃混匀，三四瓶对应加1ml细胞进12孔板，摇晃混匀。放培养箱，第二天进行转染。四、细胞转染（无酶EP管、无酶小管、全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）1、准Opti-MEM，灭菌水，mic（inhibitor），NC，Lipo3000，无酶EP管、无酶小管，96孔枪头板，12孔板、24孔板各2板（工具照紫外）2、NC、mic（inhibitor）4℃1500r1.5min离心3、分装Lipo3000tube管150μl一管（轻混），mic（inhibitor）、NC小管（换枪头加灭菌水稀释，按说明书要求），标记好4、分装Opti-MEM20ml入瓶待用5、计算好体系：(n为样品数量，N为总样品数量）Mic：①45μl+600μlOpti-MEM（12孔板）---3.75μlMic*n+50μlOpti-MEM*n；②22.5μl+300μlOpti-MEM（24孔板12个样）---1.875μlMic*n+25μlOpti-MEM*nNC：③45μl+600μlOpti-MEM（12孔板）---3.75μlNC*n+50μlOpti-MEM*n；④22.5μl+300μlOpti-MEM（24孔板12个样）---1.875μlNC*n+25μlOpti-MEM*nLP：⑤84μl+1200μlOpti-MEM（12孔板）---3.5μlLP*N+50μlOpti-MEM*N；⑥36μl+600μlOpti-MEM（24孔板12个样）---1.5μlLP*N+25μlOpti-MEM*NInhibitor：①90μl+600μlOpti-MEM（12孔板）---7.5μlinh*n+50μlOpti-MEM*n；②45μl+300μlOpti-MEM（24孔板12个样）---3.75μlinh*n+50μlOpti-MEM*nNC：③90μl+600μlOpti-MEM（12孔板）---7.5μlNC*n+50μlOpti-MEM*n；④45μl+300μlOpti-MEM（24孔板12个样）---3.75μlNC*n+50μlOpti-MEM*nLP：⑤84μl+1200μlOpti-MEM（12孔板）---3.5μlLP*N+50μlOpti-MEM*N；⑥36μl+600μlOpti-MEM（24孔板12个样）---1.5μlLP*N+25μlOpti-MEM*N6、标记好tube管：①mic45μl+600μl；②mic22.5μl+300μl；③NC45μl+600μl；④NC22.5μl+300μl；⑤LP84μl+1200μl；⑥LP36μl+600μl。①in90μl+600μl；②in45μl+300μl；③NC90μl+600μl；④NC45μl+300μl；⑤LP84μl+1200μl；⑥LP36μl+600μl。注意：LP需轻轻混匀，⑤平均分至①③；⑥平均分至②④，加后轻轻混匀。静置5min，拿出接板后的12孔板、24孔板细胞观察。7、将旧培养基吸弃，12孔板每孔1mlOpti-MEM+100μl转染液；24孔板每孔500μlOpti-MEM+50μl转染液（12个孔）8、加完晃匀，6h后换10%FBS，放培养箱42h后换诱导液开始进行诱导。五、细胞诱导分化（全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）配置储备液：IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤):分子量：222.2g/mol（Sigma:I5879）-20℃保存（难溶最后溶）用二甲基亚砜DMSO配制111.1mg/ml（0.5mol/L）储存液即：0.0115gIBMX+940ulddH2O+60ulKOH需用滤嘴过滤至新瓶子终浓度为0.5mmol/L。（现配现用）DEX：分子量：392.5g/mol（Sigma:D4902）-20℃保存用无水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol/L)储存液即：0.2mgDEX+0.5ml无水乙醇终浓度为1umol/L。Insulin：25mgInsulin+12.5mlHCl溶解后过滤，PCR小管分装，终浓度为2ug/ml，-20℃保存。1、待3T3-L1细胞在24孔板，毎板100μl原细胞体积+400μl10%FBS养2天长满，配制诱导液诱导3T3-L1分化。（先配好10%FBS两瓶100ml的）2、将旧培养液软管吸弃，PBS清洗，吸弃PBS，加入配制好的诱导液I每孔500μl于24孔板中，培养2天。3、将培养液软管吸弃，PBS清洗，吸弃PBS，用200ul的枪头慢慢加入配制好的诱导液II每孔500μl于24孔板中，培养2天。4、将旧培养液软管吸弃，PBS清洗，吸弃PBS，用10%FBS培养基培养2天。5、细胞油红O染色的操作步骤：①、10%中性甲醛的配制材料：中性甲醛(多聚甲醛)密封瓶。方法：称取1g中性甲醛粉末，加入10ml的超纯水中，密封，在60度水浴中过夜才能溶解。配好的溶液1个星期内有效，最好4度保存。②、染色液的配制材料：油红染料、棕色可密封瓶、异丙醇、针筒、滤嘴方法：称取预先研磨粉碎的0.5g油红干粉，溶于少量异丙醇中，然后加异丙醇至100ml，60℃水浴溶解，棕色瓶密封(或锡箔纸包裹避光)4℃保存，为储存液，可长期保存。用时取6ml加超纯水4ml混匀，滤嘴过滤，稀释后数小时内用完。1、吸弃培养基，用PBS洗2遍，加入10％的甲醛固定30min~1h（贴壁加），期间过滤油红2、吸弃10%甲醛，用超纯水洗2遍，60%异丙醇孵育5min3、吸弃60%异丙醇，均匀覆盖oilredO染20min（6孔板2ml，12孔板1ml，24孔板500μl）4、吸弃oilredO后，用超纯水洗2~5遍，直至无污点5、加苏木精孵育细胞1min，吸弃苏木精，超纯水2~5遍6、在细胞上加超纯水观察若转染诱导成功，重新转染诱导一批细胞，进行一系列实验：流式细胞术：（无酶枪头、1.5mltube管）注意用前灭菌1、准备接板好的12孔板细胞、无酶枪头、tube管、96孔板。2、摆好12个tube管，把原来1ml10%FBS培养基吸至tube管，一组一枪头，吸1mlPBS清洗细胞（悬空加）。吸弃PBS，一组一枪头，吸100~150μl胰酶消化细胞（两排两排消化），显微镜观察第一个，吸弃胰酶，将原培养基从tube管一一对应吸回去12孔板，并吹匀细胞，轻轻吹打。显微镜观察是否吹匀。3、将消化并吹匀的细胞悬液吸回去tube管，一对一，3000g离心5min。4、吸上清，留沉淀，大概留50μl，调950μl吸弃上清。5、悬空加入4℃冷却的PBS1ml，吹匀细胞，3000g离心5min，吸弃PBS（950μl+50μl两次小心吸弃）。6、加300μl4℃冷却的PBS，吹匀细胞，避免成团。7、缓慢悬空加入700μl预冷的70%无水乙醇，轻轻吹打均匀，4℃保存（可一周）。PI染色：1、准备好染色剂、25ml用锡箔纸包好的小瓶、24孔板、锡箔纸。算好体系，多配一个样，加入小瓶备用。现配现用，当天使用，4℃保存：染色缓冲液（n+1）*0.5ml-20℃碘化丙啶染色液（20x）（n+1）*25μl保存RNaseA（50x）（n+1）*10μl避光配制Total（n+1）*0.535ml先加多后加少容易混匀2、将样品5000g离心6min，沉淀细胞。小心吸除上清，850μl+50μl吸弃上清，预留50μl左右的乙醇，以免吸走细胞。3、加入4℃PBS，洗涤一次，离心5000g5min，沉淀细胞，小心吸除上清，850μl+50μl吸弃上清，预留50μl左右的PBS，以免吸走细胞。4、轻轻弹击tube管底，使细胞分散，避免成团。5、染色：每管样品中加入0.535ml染色液，缓慢并充分重悬细胞，37℃避光（样品放入24孔板用锡箔纸包好）温浴（放烘箱）30min，随后4℃或冰浴避光（样品垂直插入携带冰箱内冰）存放。染色完成后宜24h内或当日完成检测，最好当天完成。CV变异系数CV越低，峰值越好，越尖锐，5%左右效果较好，一般＜10%即可。提RNA的收样（无酶枪头、1.5mltube管）注意用前灭菌①一组组分好不同枪头吸弃培养基，加入500μlRNAiso放5min。②标记好无酶1.5mltube管，反复刮取、吸取细胞，将细胞移至tube管（（不不同同组组必必须须换换枪枪头头，，移移完完盖盖好好））。③收样存放-80℃。RNA提取（无酶枪头、1.5mltube管）①从-80℃冰箱取出样品↓静置5min后12000r，4℃离心10min②上清移至新的1.5mltube管并标记好↓加入51RNAisoPlus等体积的氯仿（一般为100μl）震荡摇匀③室温静置5min↓12000r，4℃离