埃博拉病毒的实验室检测

中华临床实验室管理电子杂志2014年8月第2卷第3期　ChinJClinLabMgt(ElectronicEdition),August2014,Vol.2,No.3·148·　　【摘要】　2014年埃博拉病毒感染在西非引起高致死性出血热疫情流行，目前对该病毒缺乏特异性的疫苗和治疗方案，早期快速诊断能明显降低感染死亡率。因此，埃博拉病毒早期快速检测方法的建立无论在疫情国家还是非疫情国家都非常重要。本文总结了埃博拉病毒的现有检测技术及进展。　　【关键词】　埃博拉病毒；　核酸；血清学；　免疫组化TestingmethodsinclinicallaboratoryforEbolavirus　MAXiaowei,LIMin.DepartmentofClinicalLaboratory,RenJiHospital,SchoolofMedicine,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200127,ChinaCorrespondingauthor:LIMin,Email:[e-mail]　　【Abstract】　OutbreaksofinfectionbyEbolavirus(EBOV)occurredinWestAfricacausedthehemorrhagicdiseaseswithhighlethalityin2014.Tillnow,thereisnotanyspecificvaccineortreatmentforthisdisease;earlyandrapiddiagnosisofEBOVinfectioncansignificantlyreducethemortality.Therefore,establishmentofrapidmethodsfordetectingEBOVinfectioninclinicallaboratoriesisveryimportantinthosecountrieswithorwithoutepidemicsituation.HerewereviewedtherecentprogressoftestingmethodsinclinicallaboratoryforEbolavirusinfection.　　【Keywords】　Ebolavirus;　Nucleicacid;Serology;　Immunohistochemistry•综述•埃博拉病毒的实验室检测马硝惟　李敏　　DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-5820.03.004　　基金项目：国家自然基金资助项目（81322025、81171623、81371875）；上海市卫生系统优秀青年人才计划（XYQ2011039）；上海市曙光人才计划项目（12SG03）　　作者单位：200127，上海交通大学医学院附属仁济医院检验科　　通讯作者：李敏，电子信箱：[e-mail]埃博拉病毒（Ebolavirus，EBOV）属丝状病毒科，单股负链RNA病毒，是引起埃博拉出血热（Ebolahaemorrhagicfever，EHF）的病原体。埃博拉出血热在1976年非洲中西部第一次暴发便引起医学界广泛关注。世界卫生组织（worldhealthorganization，WHO）已将EBOV列为对人类危害最严重的病毒之一[1]。目前已经确定的5种埃博拉病毒型别中，除莱斯顿型（EBO-R）对人不致病外，其余四种亚型感染后均可导致人类发病，其中扎伊尔亚型（EBO-Z）对人致病性最强[2]。该病毒自然储存宿主为果蝠[3]，但其在自然界的自然循环方式仍不清楚，通过密切接触感染人或动物的血液、分泌物、器官或其他体液传播。潜伏期短（2~21天），致死率高（最高可达90%）[4–6]，目前尚缺乏特效药物治疗。WHO将EBOV感染识别分为三个等级：（1）留观病例：发热（38.6℃以上）伴随埃博拉出血热其他典型症状，并且在发病前21天内有确诊病例、病人尸体、相关动物接触史或者在埃博拉疫区居住或旅行；（2）疑似病例：留观病例中与埃博拉确诊病例有过任何高或低风险暴露；（3）确诊病例：经实验室确诊感染埃博拉病毒[1]。EBOV感染早期症状与其他疾病有一定相似性，寻找快速、敏感、特异和适合临床开展的检测方法对及时发现病人、控制流行具有极其重要意义[7-9]。本文就埃博拉病毒当前的检测技术予以介绍。一、病毒核酸检测1.实时荧光定量逆转录PCR：随着分子生物学的发展，对已知核酸序列的病毒，采用实时荧光定量逆转录PCR（real-timequantitativereversetranscription-PCR，RT-qPCR）检测方法可对EHF进行早期诊断。国内外研究人员已根据病毒RNA依赖的RNA聚合酶（L）、核蛋白（NP）和糖蛋白（GP）等编码基因设计特异性引物或核酸探针[10-12]，通过提取患者血清、血浆或全血中的总RNA后，一般能在发病后一周内检测到病毒核酸，简便快速，在多次疫情爆发中得到应用[12-13]。利用逆转录PCR和实时定量荧光PCR相结合的检测技术是EHF早期诊断的最敏感方法[12，14]。中华临床实验室管理电子杂志2014年8月第2卷第3期　ChinJClinLabMgt(ElectronicEdition),August2014,Vol.2,No.3·149·EBOV引物设计必须兼顾各亚型的敏感性，避免其他类似出血热病毒干扰，目前一般选择EBOV高度保守的GP或NP作为扩增的靶标设计引物和探针[14]。根据GenBank上已公布的20条EBOV的NP基因序列设计出2条引物，与EBOV五种亚型同源性大于64%，而与马尔堡病毒（Marburgvirus）的NP基因序列同源性降低50%[10]。引物序列为：外套（正向引物：5'-ATGCCBGAAGAGGAGACAAC-3'，B=G/T/C；反向引物：5'-GGAARATCACCATCATGTGTCC-3'，R=A/G)，内套（正向引物：5'-GGTCAGTTTCTCTCMTTTGC-3'，M=A/C；反向引物：5'-CTGATTGCCAAGC-WGTTGGATATTG-3'，W=A/T），外套扩增产物196bp，内套扩增产物139bp；再利用SYBRGREENI荧光定量RT-PCR检测病毒，敏感度可达1.0×102拷贝/μl，因其引物中引入简并碱基，可兼顾五种EBOV亚型。2.Taqman探针：Taqman探针也可用于EBOV病毒检测，根据病毒NP蛋白基因，设计一对通用引物及特异性TaqMan探针，EBOV-Z的探针序列为5'-CAACAGCTTGGCAATCAGTTGGACA-3'，探针5'端以fam标记，3'端以淬灭基团TAMRA标记，检测范围可达104~1010拷贝/反应[11]。3.基因芯片技术：除RT-qPCR技术外，基因芯片技术被广泛应用于生物测序和基因表达分型，国内已有利用NCBI中EBOV全基因保守序列设计出20条特异性70mer寡核苷酸探针，灵敏度可达104拷贝/μl，然而其可行性验证需要在BSL-4实验室进行，成为制约其发展的重要因素[15]。4.局限性：虽然核酸检测技术有着灵敏度高、特异性强、检测速度快等优势，但仍存在以下局限性，不能成为独立诊断EBOV的特异性检测：（1）PCR检测操作中的交叉污染容易造成假阳性，在检测恢复期患者时又存在假阴性结果的倾向[12]；（2）病毒基因序列存在高度突变，利用高通量组测序技术对2014年疫情暴发的EBOV进行测序，发现395个基因突变，与以往有记录的埃博拉病毒相比，出现341个碱基替换突变，并在病毒样品中找到55个单核苷酸多态性位点[16]，导致在疫情爆发时对所有病毒亚型的检测效果并不完全准确；（3）核酸检测技术需要PCR扩增等步骤，扩增需要一定的环境和时间条件，不适用于现场快速检测。这些问题提示我们，核酸检测技术在很多情况下并不完全可靠，必须严格控制污染，不断突变的病毒基因也要求我们必须及时更新测试引物设计，避免核酸检测的误差。病毒核酸检测技术的敏感性、特异性、便捷性可在未来得到普遍应用，对病毒核酸的测序分析、寻找病毒亚型中保守而又特异性的片段是核酸检测技术未来的发展方向。二、血清学检测1.病毒抗原检测：EHF早期存在高滴度病毒血症，可达109~1011病毒颗粒/L，可采用双抗体夹心ELISA或免疫荧光方法检测血清中病毒抗原。已有实验室通过制备病毒GP蛋白、VP40蛋白等单克隆抗体对EBOV进行抗原捕获检测[17,18]，其中利用免疫层析法可快速检测EBOV抗原，并在2003年EHF疫情暴发中得到应用，但其检测仅限于EBO-Z和EBO-S二种亚型[19]。患者在出现症状3~6天后即可检测出抗原，7~16天内在幸存者体内抗原水平逐渐下降并消失，而死亡病例中的血清抗原水平逐渐上升直至死亡[20，21]。虽然敏感性不及核酸检测，但该方法仍可以对早期疑似患者进行筛查检测，其检测病毒类型受制于包被抗体蛋白的种类，难以同时覆盖所有病毒亚型，不适于在不明原因的出血热疫情中进行筛查检测。联合应用核酸检测和抗原检测，能够快速特异地帮助临床确诊。2.病毒特异性抗体检测：采用ELISA或免疫荧光法可检测血清中EBOV特异性IgM和IgG抗体。IgM抗体在发病后2天出现，1个月至半年后消失；IgG抗体出现时间较晚，一般在发病后6~18天出现可，维持数年。多数患者的抗体出现于起病后10~14天，部分重症患者至死也未能检出抗体，故IgG抗体检测主要用于血清流行病学调查[22]，IgM抗体可作为近期感染的血清流行病学调查指标，早期阴性并不能排除感染存在，不能满足早期诊断需求[23]。3.病毒分离培养：作为专性胞内病原体，EBOV需要在宿主细胞内完成生命周期，多种传代细胞株均可用于病毒分离[24]。出血热急性期患者的血样或组织样本均可检测出病毒抗原。用Vero、Hela等细胞进行病毒分离，选取单克隆或多克隆单抗，利用免疫荧光等手段进行检测[25]，最常采用Vero细胞和VeroE6细胞。发病一周内血标本病毒分离率较高，其敏感性受EBOV型别影响，EBO-Z用Vero细胞分离阳性率较高，MA-104细胞对EBO-R和EBO-S敏感，EBO-S则需盲传数代才可检出抗原，分离阳性率也较低[26]。中华临床实验室管理电子杂志2014年8月第2卷第3期　ChinJClinLabMgt(ElectronicEdition),August2014,Vol.2,No.3·150·利用豚鼠和猴亦可进行病毒分离培养[27]。检测动物感染发病后的血液组织可获得病毒抗原，但动物培养分离较细胞培养更困难，耗时更长。虽然病毒分离培养是病毒抗原检测的可靠方法，由于EBOV致病性高，病毒培养、动物感染等试验必须在BSL-4/ABSL-4级实验室内进行，国内尚无相应条件，国际上也仅有为数不多的实验室可进行该项分离培养试验，并且难以控制和保障长途运输感染标本的条件，因此该项技术并不适于大部分地区在病毒暴发流行时的检测。4.免疫组化检测：免疫组化法可以检测动物和疑似病例尸检标本中的病毒抗原，感染动物和人的皮脂腺周围血管结构中病毒抗原呈阳性。死亡动物或人的活检皮肤标本经甲醛固定后，利用免疫组化技术，采用多克隆或单克隆抗体检测病毒抗原[28]。此方法无需冷藏标本，标本固定后的操作相对安全，诊断可靠、敏感，但其通常需耗时数天[29]，对人体有一定创伤，不适用于疾病的快速诊断和流行病筛查。5.电镜观察：直接使用电镜观察标本中的病毒颗粒，是敏感且直接的检测方法[30]。通过负染色，使用电镜可观察到各种体液标本、培养细胞、组织标本中的病毒颗粒，利用间接免疫电镜法可辨认组织及血清中的EBO-R病毒颗粒，敏感度达300pfu/ml[31]，通过电镜，我们可直观了解病毒结构，是重要的科学研究手段[32]。但电镜设备昂贵，需要操作人员技术熟练，对病毒滴度要求高，不适合在临床实验室中开展常规检测。三、总结综上所述，现已有多种检