海红果酚类物质种类及其抗氧化能力的研究

现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2013,Vol.29,No.112633海红果酚类物质种类及其抗氧化能力的研究王猛1，王敏1，李环宇1，王勇2，武和平2（1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100）（2.榆林市西府海棠产业开发研究有限公司，陕西府谷719400）摘要：本文旨在探讨海红果抗氧化活性及其酚类物质组成，利用超声波法提取海红果不同部位的抗氧化物质并测定其总酚和总黄酮含量，应用DPPH·自由基清除能力、ABTS+·自由基清除能力和总还原力三个指标考察其抗氧化活性；利用HPLC法考察海红果酚类物质组成。实验结果发现，去核海红果总酚含量和总黄酮含量分别达160±5.03mggalicacidq./100gFW和54.45±1.52mgrutineq./100gFW，显著高于海红果皮和果肉，总黄酮含量与三个抗氧化指标均存在显著正相关关系，而总酚含量与三个抗氧化指标存在正相关关系但不显著，表明黄酮类物质对海红果抗氧化活性贡献较大。海红果酚类物质以羟基苯甲酸类（香草酸、没食子酸等）为主，海红果皮中黄酮醇类含量最高，黄烷-3-醇类的儿茶素和表儿茶素只在海红果肉中检出。在所有检出物质中，海红果皮内芦丁含量最高为（819.88±10.17μg/100g），此外绿原酸等是海红果中重要的酚类组成物质。关键词：海红果；酚类物质；抗氧化能力文章篇号：1673-9078(2013)11-2633-2637MalusmicromalusMakinoPolyphenolsandItsAntioxidantActivityWANGMeng1,WANGMin1,LIHuan-yu1,WANGYong2,WUHe-ping2(1.CollegeofFoodScienceandEngineering,NorthwestA&FUniversity,Yangling712100,China)(2.Company,YulinXifuhaitangIndustrialDevelopmentCo.,Ltd.,Fugu719400,China)Abstract:ToexploretheantioxidantactivityandthepolyphenolsofMalusmicromalusMakino,theultrasonicmethodwasutilizedtoextracttheantioxidantsfromdifferentpartsofthefruit,theirtotalphenolic(TP),totalflavonoid(TF)contents,phenoliccompoundsandantioxidantactivitieswereanalyzed.Theantioxidativecapacityoftheextractswasevaluatedbyreducingpower,DPPH·andABTS·+scavenging,whileHPLCwasusedtoinvestigatethecompositionofpolyphenols.ThecontentsofTPandTFindenucleatedMalusmicromalusMakino(DM)were60±5.03mggalicacidq/100gFWand54.45±1.52mgrutineq/100gFW,respectively,beingsignificanthigherthanthoseinpeelandpulpofthefruit.TherewereobviouspositivecorrelationsbetweenTFcontentandthethreeantioxidantactivityindices.AndTPcontenthadlesspositivecorrelationswiththethreeindices.Hydroxybenzoicacidsincludingvanillicacid,gallicacidwerethemainpolyphenolsofMalusmicromalusMakino.Inaddition,flavonolsgainedthehighestcontentsinpeels.Andcatechinandepicatechinwereonlydetectedinpulp.Inalldetectedsubstances,thecontentofrutininpeelswasthehighestwith819.88±10.17μg/100g.Moreover,chlorogenicacidwasalsoanimportantphenoliccompoundinMalusmicromalusMakino.Keywords:MalusmicromalusMakino;polyphenols;antioxidantactivity海红学名西府海棠（MalusmicromalusMakino），又名海红子、子母海棠、小果海棠，属于蔷薇科（Rosaceae）梨亚科（Pomoideae）苹果属落叶小乔木，主要分布在我国晋、陕、蒙三省（区）交界处的黄土丘陵沟壑地区[1]。海红其果实营养丰富，经常食用可健胃消食、增强食欲，软化血管，而某些地区则以海红果代替山楂入药，具有醒脑提神、去腻除腥的功效收稿日期：2013-07-09基金项目：西府海棠食品化学分析与加工技术研究（A304021303）作者简介：王猛（1989-），男，博士生，研究方向为食品化学与营养通讯作者：王敏（1967-），女，博士，教授，研究方向为食品化学与分析和西部特色药食兼用资源加工利用[2]。黄土高原地区由于历史上的过度的滥砍滥伐，造成了严重的水土流失，生态环境遭到巨大的破坏，而海红具有抗寒、耐旱、耐湿、耐盐碱等植物学特性，因此，海红是不可多得的黄土高原旱区环境改良树种。现代研究表明，机体的衰老与活性氧如超氧阴离子自由基（O2-·）和羟自由基（·OH）产生的氧化胁迫有关，而海红优良的抗逆性，使其果实中含有更为丰富的植物次生代谢产物，具有天然抗氧化剂的潜力。目前关于海红的研究主要在国内，徐玉霞等研究了大孔吸附树脂法纯化海红果黄酮工艺，且利用酶法提取海红果总黄酮并研究了粗提物对Hela细胞的增殖作用；程正涛等[3]利用响应面法优化了海红果多酚的提取工艺，现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2013,Vol.29,No.112634得海红果多酚得率为9.25mg/g；郝志鹏等[4]研究了海红果多糖的提取工艺条件及其体外抗氧化活性，海红果多糖具有较强的清除自由基能力，具有较强的体外抗氧化活性；梁泰刚等[5]则利用RP-HPLC法同时测定了海红果中4种黄酮成分的含量，可见目前海红果研究集中在多酚和黄酮等活性物质的提取及活性研究，有关海红果酚酸组成及抗氧化活性研究尚未见报道。本文对海红果果皮和果肉中总酚和总黄酮含量进行分析，并采用三种抗氧化指标考察了其抗氧化能力，同时采用HPLC法测定其酚类物质类型及含量，以期为提高海红果营养功能性认识和推动其开发利用提供基础资料。1材料与方法1.1原料与试剂海红果于2012年11月20日采自陕西府谷，采摘后贮藏在0~4℃冷库内保鲜。二苯基苦肼基(DPPH)、水溶性VE、2,2-联氮-双(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)，福林酚试剂，美国Sigma公司；没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、表儿茶素、对香豆酸、阿魏酸、鞣花酸、肉桂酸、槲皮素和芦丁等标准样品纯度均为色谱纯，金测分析技术天津有限公司；其他试剂均为分析纯。1.2仪器与设备LC-2010AHT液相色谱仪,日本岛津公司；KQ-700DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；调速多用振荡器，常州国华电器有限公司；JD400-3，电子分析天平、ESJ120-4电子天平、JD200-3电子天平，沈阳龙腾电子有限公司；ESB-300，均质机、QL-901漩涡仪海门市其林贝尔仪器制造有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；721型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司。1.3方法1.3.1海红果抗氧化物质提取挑取无病害的海红果，去核。参照Gao等[6]方法并略作改进。取鲜样20g，按照1:3（m/V）比例加入甲醇-水（4:1，V/V）溶液60mL后，超声提取20min,离心收集上清液，重复提取三次，合并上清液45℃旋转蒸发，色谱纯甲醇溶解定容至25mL，置于-20℃冰箱中以待下一步分析。1.3.2总酚含量测定总酚含量的测定采用福林酚法。125μL抗氧化提取物中加入125μL福林酚试剂反应6min，加入1.25mLNa2CO3溶液终止反应。加入1mL蒸馏水静置90min于波长760nm测定吸光值。以没食子酸作为标准品。样品的总酚含量以每百克鲜样所含没食子酸的当量毫克数(mggalicacideq./100gFW)表示。1.3.3总黄酮含量测定总黄酮含量采用比色法测定。125μL抗氧化提取物中加入200μL5%NaNO2溶液，摇匀，6min后加入200μL10%Al(NO3)3溶液，摇匀，6min后加入2mL4%NaOH溶液，加蒸馏水补齐至5mL。置于暗处15min在波长510nm处测定吸光值。以芦丁作为标准品，样品的总黄酮含量以每百克鲜样所含芦丁的当量毫克数（mgrutineq./100gFW）表示。1.3.4抗氧化活性测定抗氧化活性测定及酚类物质分析方法参照Gao等[7]所述。清除DPPH·自由基实验，以Trolox为标准品，有所改进后进行实验。抗氧化提取液与DPPH甲醇溶液反应30min，波长517nm处测定吸光值。样品清除DPPH·自由基能力以每百克鲜样所含Trolox的当量毫摩尔数表示(mmolTroloxeq./100gFW)。总还原力测定。1mL抗氧化提取液，加入0.2mol/LpH6.6的磷酸缓冲液和1%铁氰化钾溶液各2mL，振匀后50℃水浴反应20min后，再加入2mL10%三氯乙酸终止反应。振荡1min，混匀。取此溶液1mL，加入1mL蒸馏水和0.2mL0.1%三氯化铁溶液，混合均匀，置于暗处30min，在700nm测定吸光值。以维生素C做为标准对照品，总还原力以每百克鲜样所含维生素C当量的毫克数（mgVitaminCeq./100gFW）来表示。清除ABTS+·自由基能力测定。抗氧化提取液与ABTS+·溶液（5mmol/L，pH7.4）振摇混匀，30s后在波长734nm处测定吸光值。以Trolox做为标准对照品。清除ABTS自由基能力以每百克鲜样所含Trolox当量毫摩尔数(mmolTroloxeq./100gFW)表示。1.3.5酚类物质分析HPLC分析样品的制备：20g样品加入40mL乙酸乙酯，超声提取30min，4000r/min离心10min，收集上清液，重复提取三次。合并上清液，35℃旋转蒸干。然后用甲醇溶解并定容至5mL，-20℃冰箱中保存备用。测试前用0.45µm针头式过滤器过滤。色谱条件：色谱柱：WatersSymmetryC18柱（4.6mm×150mm，5µm），紫外检测波长：280nm（主要），320nm(次要)；柱温：30℃，进样量：20µL，流速：现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2013,Vol.29,No.1126350.8mL/min，流动相A：甲醇，流动相B：超纯水（用磷酸调pH为2.6）。梯度洗脱程序：0min15%A，85%B；15~25min25%A，75%B；65min75%A，25%B；70min15%A，85%B。1.3.6数据统计与分析数据统计分析采用DPS数据处理系统，所有样品进行3次重复，结果以平均值±标准差(x±s)表示。2结果与讨论2.1海红果不同部位的总酚和总黄酮含量海红果不同部位的总酚和总黄酮含量测定结果如表1所示。由表1可以看出，