根系活力的测定

根系活力的测定（TTC法）植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的生长和营养状况及产量水本。本实验练习测定根系活力的方法，为植物营养研究提供依据。一、原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲腙，生成的三苯甲腙比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛地用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标。二、材料、设备仪器及试剂（一）材料：水培或砂培小麦、玉米等植物根系。（二）仪器设备：1.分光光度计；2.分析天平（感量0.1mg）；3.电子顶载天平（感量0.1g）；4.温箱；5.研钵；6.三角瓶50ml；7.漏斗；8.量筒100ml；9.吸量管10ml；10.刻度试管10ml；11.试管架；12.容量瓶10ml；13.药勺；14.石英砂适量；15.烧杯10ml、1000ml。（三）试剂：1.乙酸乙酯（分析纯）。2.次硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末。3.1％TTC溶液准确称取TTC1.0g，溶于少量水中。定容到100ml。用时稀释至各需要的浓度。4.磷酸缓冲液（1／15mol/L，pH7）。5.1mol/L硫酸用量筒取比重1.84的浓硫酸55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml。6.0.4mol/L琥珀酸称取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100ml即成。三、实验步骤（1）TTC标准曲线的制作取0.4％TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后立即产生红色的甲月替。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲月替25μg、50μg、100μg、150μg、200μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。（2）称取根尖样品0.5g，放入10ml烧杯中，加入0.4％TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗保温1～3h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，其他操作同上）。（3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3～4ml和少量石英砂一起在研钵内磨碎，以提出甲月替。红色提取液移入试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二、三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。四、结果计算四氮唑还原强度（mg/g(根鲜重)/h）＝四氮唑还原量（mg）/[根重（g）×时间(h)]植物组织内过氧化物酶(POD)活性的测定（实验测试用）原理：过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在470nm处有最大吸收峰，可根据单位时间内A470的变化值，计算POD活性大小。仪器：电子天平；冰冻高速离心机；可见光分光光度计；电动玻璃匀浆剂等。试剂：20mMKH2PO4；100mMPBS：取0.2MNa2HPO4，87.7ml与0.2MNaH2PO4，12.3ml混合。反应液：取100mMPBS50ml，加入愈创木酚28μl，搅拌溶解，待溶液冷却后加入30%的H2O219μl，混合均匀保存于冰箱中备用。方法：1.酶液制备：取1.0g植物叶片剪碎，置入玻璃匀浆杯中，加入预冷的20mMKH2PO45ml进行冰浴研磨提取。匀浆液低温离心8500rpm15min，上清液为酶粗提液，定容到50ml供测定。2.酶活性测定：取光程为1cm的玻璃比色杯2只，一只加入反应液3ml，20mMKH2PO41ml作为调零管。另一只加入反应液3ml，提取的酶液1ml，立即开始计时，在470nm波长处进行比色，开始记录数据，然后每隔一分钟记录一次吸光度值，共测3min。3.计算：以每分钟A470的化变值0.01为一个相对酶活单位，计算植物组织内过氧化物酶酶活力的大小（单位：U/g鲜重）。过氧化氢酶测定过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。一、原理：过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。即可求出消耗的H2O2的量。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦叶片（二）仪器设备：1.研钵；2.三角瓶；3.酸式滴定管；4.恒温水浴；5.容量瓶。（三）试剂：1.10%H2SO4；2.0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液；3.0.1mol/L高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L草酸溶液标定；4.0.1mol/LH2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/LKMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5.0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。四、实验步骤（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。（二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml0.1mol/LH2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。用0.1mol/LKMnO4标准溶液滴定，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。五、结果酶活性用每g鲜重样品1min内分解H2O2的mg数表示：过氧化氢酶活性（H2O2mg/g/min）＝（A－B）×VT/(W×VS×1.7×t)式中：A对照KMnO4滴定ml数；B酶反应后KMnO4滴定ml数；VT提取酶液总量（ml）；VS反应时所用酶液量（ml）；W样品鲜重（g）；t反应时间（min）；1.71ml0.1mol/LKMnO4相当于1.7mgH2O2。超氧物歧化酶（SOD）活力一、原理超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。二、材料、仪器设备及试剂（一）材料；水稻或小麦叶片（二）仪器设备：1.高速台式离心机；2.分光光度计；3.微量进样器；4.荧光灯（反应试管处照度为4000Lx）；5.试管或指形管数支。（三）试剂1.0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）；2.130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；3.750μmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；4.100μmol/LEDTA－Na2溶液：称取0.03721gEDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；5.20μmol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。三、实验步骤1.酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。取1.5～2ml于1000rpm下离心20min，上清液即为SOD粗提液。2.显色反应取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.05mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/LMet溶液0.313mmol/L750μmol/LNBT溶液0.375μmol/L100μmol/LEDTA－Na2液0.310μmol/L20μmol/L核黄素0.320μmol/L酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处，其它各管于4000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。3.SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的对照管做空白，分别测定其它各管的吸光度。四、结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。SOD总活性＝(Ack－AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt)上式中，SOD比活力＝SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位／mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积（ml）Vt测定时样品用量（ml）W样鲜重（g）蛋白质含量单位为：mg蛋白／g鲜重。