骨组织形态计量学方法

2.5.4骨组织形态计量学方法2.5.4.1不脱钙骨骨标本的包埋（1）包埋前单体（甲基丙烯酸甲酯）的洗脱方法①将1500ml的甲基丙烯酸甲酯倒入分液漏斗（2L）中。②加入5%NaOH溶液500ml，充分摇匀，静置，待溶液分层后，放出下层溶液，弃去。③重复操作“2”三次，三次的总量与单体量相当（洗脱阻滞剂）。④加入500ml蒸馏水，充分摇匀，静置，待溶液分层后，放出下层溶液，弃去。⑤重复操作“2”三次，三次的总量与单体量相当（洗脱NaOH）。⑥将上述处理过的单体放入无水CaCl2（1000ml：500g）脱水2次。⑦滤纸过滤，收集滤液。⑧-20℃保存备用，第二天取出看有无冰晶漂浮：无，表明无水可备用；有，则需重新脱水。（2）胫骨上段包埋前的制备过程①暴露骨髓腔将固定液中的胫骨用低速锯锯开，暴露骨髓腔，解剖部位如下：②脱水分别通过70%乙醇2天，95%乙醇2天，100%乙醇1天，100%乙醇1天，四个脱水过程，二甲苯透明1天。③渗透先后用浸液Ⅰ、浸液Ⅱ、浸液Ⅲ分别浸透2天。三种浸液的配制方法如下：浸液Ⅰ甲基丙烯酸甲酯90ml，邻苯二甲酸二丁酯10ml，磁力搅拌器上搅拌3小时。浸液Ⅱ甲基丙烯酸甲酯90ml，邻苯二甲酸二丁酯10ml，过氧化笨甲酰1.0g，磁力搅拌器上搅拌4小时。浸液Ⅲ甲基丙烯酸甲酯90ml，邻苯二甲酸二丁酯10ml，过氧化苯甲酰2.5g，磁力搅拌器上搅拌6小时。（3）包埋用新鲜配置的浸液Ⅲ（当日配置）倒入装有浸润好的骨头块容积约为15ml的小瓶中，倒入的包埋剂约，盖好瓶盖，并在瓶盖上插一注射器针头，室温过夜。第二天把包埋瓶置入37-39℃的水育箱中聚合约48小时，直至包埋块形成。若为胫骨中段骨，则需在包埋前几天预先倒入少量包埋剂于小玻璃瓶中作包埋块底衬，变硬后为1.5cm高为宜。包埋时将胫骨中段至于瓶中央，在倒入2cm高的包埋剂。若为胫骨上段，仅需将其锯开面贴瓶底中央包埋，倒入约3.5cm高的包埋剂即可。2.5.4.2不脱钙股组织片的制备（1）载玻片的制备①清洗把玻片在酸缸中浸泡24小时，取出，先用自来水冲洗，后用单蒸水冲洗，晾干。②上胶称取1.8g明胶溶于200ml的双蒸水中，加热溶解明胶（90度）称取1g的硫酸铬钾溶于25ml的双蒸水中，待其完全溶解后缓缓倒入沸腾的明胶溶液中，边加边搅拌，直至其完全溶解再停止加热，溶液室温冷却至60℃左右即可使用；将载玻片浸入60℃的胶液中2min，取出晾干后即可使用。（2）切片①打磨用石膏打磨机将包埋块打磨成合适大小，并暴露切面，把切面打磨到合适位置。②切片将打磨好的块固定在切片机上，右手慢慢切下。同时，左手用一沾有40%乙醇的软毛刷轻轻地拨下切片，注意不要弄烂切下的片，然后用毛刷把片转移到滴有一滴70%酒精的载玻片上，再滴一滴70%酒精，然后漫漫展平切片，盖上一张薄塑料片，并用滤纸将多余的酒精吸干。一个标本切两种厚度的片5μm（薄片）和9μm（厚片）：薄片用于Masson-GoldnerTrichrome染色数破骨细胞；厚片可直接封片，测量动态参数；或硝酸银染色，测量静态参数。③烤片将切好的一组片，用夹子夹稳，放入40℃左右的鼓风烤箱中烤4小时左右，取出备用。（3）骨片染色5μm的薄片常采用Masson-GoldnerTrichrome染色，染色后，骨质为绿色，骨髓为红色，用于观察骨小梁表面的破骨细胞和测量其周长。9μm的厚片可采用硝酸银染色，染色后，骨质为黑色，反映矿化后的骨质，用于观察骨量和骨结构，下面是Masson-GoldnerTrichrome染色过程。①工作液的准备A．Weigerthematoxylin工作液：溶液A含Mematoxylin（苏木素精）1g加入95%酒精100ml中过滤备用；溶液B含29%氯化铁4ml、稀盐酸1ml（用40%的盐酸加蒸馏水1:4稀释），然后加蒸馏水至100ml。将等份的溶液A和溶液B混合即得工作液。B.PonceanFuchsinStock工作液：配制溶液A含Poncean（丽春红）1g加蒸馏水100ml，溶液B含AcidFuchsin（品红）1g加蒸馏水100ml；将3份的溶液A和1份的溶液B混合配成原液，然后将原液用0.2%的醋酸按5:1的比例稀释成工作液。C.Phosphotungsticacid-OrangeG工作液：将OrangeG2g和Phosphotungsticacid4g加入100ml蒸馏水中，用前过滤。D.Lightgreen工作液：将Lightgreen（亮绿）0.2g和醋酸0.2ml加入100ml蒸馏水中，用前过滤。②染色过程脱塑剂2-Methyloxethylacetate25min2次↓Weigertshematoxylin工作液25min↓蒸馏水漂洗↓自来水漂洗10min↓蒸馏水漂洗↓Poncean-Fuchsin工作液染色17min↓1%醋酸漂洗2次，每次1min↓新鲜过滤的OrangeG液染色7min↓1%醋酸漂洗2次，每次1min↓新鲜过滤的Lightgreen染色15min-20min↓1%醋酸漂洗2次，每次1min↓95%酒精脱水1min↓无水酒精脱水2min，2次↓二甲苯清洗2次，每次2min，树脂封片（4）磨片制备磨片是将胫骨中段先用锯片机锯成100μm厚的骨片，锯骨时从胫腓韧带联合近侧端以胫骨干下端与腓骨完全分离为有效骨片，可尽量减少切片所造成的误差。共锯三片，胫腓结合处为第一片，接下来依次为第二、三片。在磨砂玻璃上将第二片磨成40μm的薄片，再进行酒精梯度脱水：70%-70%-95%-95%-100%-100%，二甲苯透明后树脂封片，测量皮质骨的各项参数。2.5.4.3骨组织形态计量学指标测定（1）测量分析范围胫骨上段测量范围：从生长板往下画出0.5mm，以避开初级海绵体，再从0.5mm处往下画3mm。见图2.5。皮质骨测量范围为横断面，见图2.6图2.5胫骨上段测量范围图2.6皮质骨测量范围Fig2.5ScopeofPTMforbonehistomorphometryFig2.6ScopeofMTMformeasure（2）动、静态参数测量和计算本实验所有参数采用国际通用标准骨组织形态计量学术语命名[24-25]。用半自动图象数字化仪直接测出参数的中英文名称、符号及单位等如表2.3和表2.5所示。但这些参数还不能直接用于分析骨量、骨结构、骨形成和骨吸收等,要通过国际通用的公式[21]对直接测得的参数计算，才能用于分析。计算参数的中英文名称、符号及计算公式等如表2.4和表2.6所示。表2.3松质骨测量参数Tab2.3MeasurementsofPTMcancellousbone中文名称英文名称符号单位骨组织面积TissueareaT.Armm2骨小梁面积TrabecularboneareaTb.Armm2骨小梁周长TrabecularperimeterTb.Pmmm单荧光周长SinglelabelperimetersL.Pmmm双荧光周长DoublelabelperimeterdL.Pmmm双荧光间距InterlabelwidthIr.L.Wium破骨细胞数量osteoclastnumberN.Oc#破骨细胞周长ostelclastperimeterOc.Pmmm表2.4松质骨计算参数及计算公式Tab2.4CalculationsofPTMcancellousbone中文名称符号单位公式骨小梁面积百分数%Tb.Ar%Tb.Ar/T.Ar*100骨小梁宽度Tb.Wium(2000/1.199)(Tb.Ar/Tb.Pm)骨小梁数量Tb.N#/mm(1.199/2)*(Tb.Pm/T.Ar)骨小梁分离度Tb.Spum(2000/1.199)*(T.Ar-Tb.Ar)/Tb.Pm荧光周长百分数%L.Pm%(dL.Pm±sL.Pm/2)/Tb.pm*100骨矿化沉积率MARum/dIrL.Wi/intervel骨形成率BFR/BSum/d*100（L.Pm±sL.Pm/2）*MAR/Tb.Pm*100BFR/BV%/year（dL.Pm±sL.Pm/2）*MAR/1000/Tb.Ar*365*100BFR/TV%/year（dL.Pm±sL.Pm/2）*MAR/1000/T.Ar*365*100单位骨小梁面积破骨细胞数Oc.N#/mmN.Oc/Tb.Ar破骨细胞周长百分率Oc.Pm%%Oc.Pm/Tb.Pm*100表2.5松质骨测量参数Tab2.5HistomorphometricmeasurementsofTxcorticalbone中文名称英文名称符号单位骨组织总面积TotaltissueareaT.Armm2骨髓总面积MarrowareaMa.Armm2骨外膜面周长PeriostealperimeterP.Pmmm骨内膜面周长EndBGPorticalperimeterE.Pmmm骨外膜面单荧光周长SinglelabelperimeterP.sL.Pmmm双荧光周长DoublelabelperimeterP.dL.Pmmm双荧光间距InterlabelwidthP.Ir.L.Wium骨内膜面单荧光周长SinglelabelperimeterE.sL.Pmmm双荧光周长DoublelabelperimeterE.dL.Pmmm双荧光间距InterlabelwidthE.Ir.L.Wium骨吸收周长ErodedperimeterEr.Pmmm表2.6皮质骨计算参数及计算公式Tab2.6HistomorphometriccalculationsofTxcorticalbone中文名称符号单位公式皮质面积Ct.Armm2Tb.Ar-Ma.Ar皮质面积百分率%Ct.Ar%Ct.Ar/T.ar*100骨髓面积百分率%Ma.Ar%Ma.Ar/T.Ar*100骨外膜标记周长百分率%P-L.Pm%(P-dL.Pm+P-sL.Pm/2)/P.Pm*100骨外膜骨矿化沉积率P-MARum/dP-Ir.L.Wi/Interval骨外膜骨形成率P-BFR/BSum/d*100P-L.Pm*P-MAR/P.Pm*100骨内膜标记周长百分率%E-L.Pm%(E-dL.Pm+E-sL.Pm/2)E.Pm*100骨内膜骨矿化沉积滤E-MARum/dE-Ir.L.Wi/Interval骨内膜骨形成率E-BFR/BSum/d*100E-L.Pm*E-MAR/E.Pm*100（3）参数的意义①静态参数用来评价药物防治效果，描述骨量多少和骨小梁的形态结构。骨小梁面积百分数（%Tb.Ar）指骨小梁面积占骨组织面积的百分率，反映骨量的多少。从数学公式上推算，它等于骨小梁宽度与数量的乘积的1/10，也就是说，骨量多少由宽度和数量二者共同决定。骨小梁宽度（Tb.Th）用于描述骨小梁结构形态，解释骨量变化。其变化可影响骨量，在数量一定的条件下，宽度越宽，骨量越多。骨小梁数量（Tb.N）用于描述骨小梁结构形态，解释骨量变化。其变化可影响骨量，在宽度一定的条件下，数量越多，骨量越多。骨小梁分离度（Tb.Sp）指骨小梁之间的平均距离，用来描述骨小梁结构形态。分离度越大，骨小梁之间距离就越大，骨就越疏松。皮质骨面积（Ct.Ar）反映皮质骨骨量的多少，是中段骨组织横截面与骨髓腔面积之差。皮质骨面积百分数（Ct.Ar%）反映皮质骨在中段骨横截面总骨组织面积中所占比例。骨髓腔面积百分数（%Ma.Ar）反映骨髓腔在中段骨横截面总骨组织面积中所占比例。②动态参数动态参数包括骨形成参数和骨吸收参数，通过动态参数，可以了解骨表面矿化的量和速率，并解释静态参数变化的原因。A.骨形成参数荧光周长百分率（%L.Pm）反映进行矿化的骨周长占骨表面总周长的百分率，也反映成骨细胞的数量。矿化沉积率（MAR）指每天矿化的宽度。反映骨矿化的快慢，代表成骨细胞的活性。骨形成率（BFR/BS）%L.Pm与MAR的乘积，代表骨表面形成的活跃程度。骨形成率（BFR/BV）每年新形成的骨小梁面积占骨小梁总面积的百分比，代表骨形成和骨转换的活跃程度。此参数越高，表示骨转