质粒抽提技术

质粒DNA的提取和纯化基因工程移液器和EP管质粒•质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，独立于染色体之外的、能自主复制的双链环状脱氧核糖核酸物质。•质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。•能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。•现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。分类：单拷贝质粒；多拷贝质粒；紧密控制型；松弛控制型；质粒DNA的提取方法•碱裂解法；•煮沸裂解法；•酚氯仿抽提法；概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理。基本思路1.培养细菌使质粒扩增；2.收集和裂解细菌；3.分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)4.电泳检测；碱裂解法的基本原理•十二烷基磺酸钠(SDS)可使细胞膜裂解。•经SDS处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。•当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA和蛋白质变性，而共价闭合环状DNA(CovalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开。•当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。实验步骤1、将含有质粒的DNA细菌在LB培养基中培养过夜。取1.5mlLB培养液倒入1.5mleppendorf管中，4℃下4000rpm离心5min。2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中（需剧烈振荡）。4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴2分钟。5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，颠倒混匀，冰浴中5-10分钟，4℃下12000g离心10分钟。6、上清液（450uL）移入干净eppendorf管中，加入等体积的饱和酚（1:1），充分颠倒混匀，4℃下12000g离心10分钟。7、将水相（400uL）移入干净eppendorf管中，加入等体积酚/氯仿，颠倒混匀，12000rpm离心10min。8、将水相（350uL）移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入0.5ml70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心10分钟。9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。10、将沉淀溶于10μlTE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，储于-20℃冰箱中。LB液体培养基（Luria-Bertani）•称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。溶液I•50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱溶液I：重悬细菌；葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀；Tris－HCl：缓冲体系；EDTA：螯合金属离子；溶液Ⅱ•1mol/LNaOH200l•10%SDS100l•H2O700l溶液II——破膜，变性基因组DNA和蛋白质；SDS——破膜作用，解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性；NaOH——(pH12)，破坏氢键，变性基因组DNA；溶液Ⅲ•5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。溶液III——中和溶液，复性质粒DNA；酚/氯仿（1:1）酚——变性蛋白质；氯仿——萃取溶液中的酚；分为两层，上层为水层，下层为酚氯仿混合液。吸取时不要震荡。乙醇无水乙醇（2倍体积）——沉淀质粒DNA；70%乙醇——洗涤质粒DNA沉淀，除去沉淀中的盐分；琼脂糖凝胶•从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。•凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。因此琼脂糖凝胶可作为分子筛，常用于凝胶层析和电泳。电泳6×loadingbuffer2l样品10lMarker10l•120V,电泳30min，•电泳结束，紫外灯下观察结果混匀，上样混匀，上样BM5000DNAMarker电泳鉴定•其中超螺旋结构泳动最快；•其次为线性结构；•最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起）；