天然产物抗氧化活性的常见评价方法

2013年第32卷第6期CHEMICALINDUSTRYANDENGINEERINGPROGRESS·1205·化工进展天然产物抗氧化活性的常见评价方法曾维才，石碧（四川大学皮革化学与工程教育部重点实验室，四川成都610065；四川大学生物质与皮革工程系，四川成都610065）摘要：天然产物抗氧化活性的评价是天然产物研究的重要组成部分，对其在日化领域的开发应用具有显著的指导意义。本文从实验原理、实验方法等方面对天然产物抗氧化活性的常见评价方法进行综述，详细介绍了化学分析法中的自由基（ABTS自由基阳离子、DPPH自由基、超氧自由基、羟自由基）清除实验、脂质过氧化抑制实验、还原能力测定及脂质氧化抑制等评价方法；描述了以生物细胞为模型的CAA抗氧评价方法；概述了在动物体内进行的抗氧化活性评价方法及指标，为相关领域中抗氧化天然产物的研究和开发提供实验理论基础。关键词：天然产物；抗氧化活性；评价方法中图分类号：TS201文献标志码：A文章编号：1000–6613（2013）06–1205–10DOI：10.3969/j.issn.1000-6613.2013.06.001Commonmethodsofantioxidantactivityevaluationfornaturalproducts：AreviewZENGWeicai，SHIBi（KeyLaboratoryofLeatherChemistryandEngineeringofMinistryofEducation，SichuanUniversity，Chengdu610065，Sichuan，China；DepartmentofBiomassandLeatherEngineering，SichuanUniversity，Chengdu610065，Sichuan，China）Abstract：Evaluationofantioxidantactivityisimportantfortheinvestigationofnaturalproducts，andistheusefulguidefortheirapplicationinchemicalindustry.Inthepresentstudy，sometypicalanalyticalmethodsforevaluationoftheantioxidantactivityofnaturalproductsarereviewedintermsoftheirchemicalmechanismsandcommonprocedures.Theinvitromethods，suchasfreeradical(ABTS，DPPH，superoxideandhydroxylfreeradical)scavenging，lipidperoxidation，reducingpowerandfatoxidationassaysareintroduced.Meanwhile，thecellularantioxidantactivity(CAA)experimentbasedondeterminationofthevitalityofcellsisalsodescribed.Furthermore，thetestingproceduresandfactorsofinvivomethodinanimalsaregiven.Thisreviewmightbeusefulfortherelatedresearchofnaturalproducts.Keywords：naturalproducts；antioxidantactivity；analyticalmethod化学学科中，天然产物特指从动物、植物、海洋生物及微生物体内分离的二次代谢产物和内源性化合物[1-2]，主要有生物碱、植物多酚、多肽、糖苷、挥发油、激素、萜类、甾类、维生素等几大类[3]。因富含对人体健康有益的活性成分，天然产物在医药、食品、化妆品、保健品等领域得到了广泛应用[4]。专门研究天然产物活性成分的功能及结构的科学称为天然产物化学[5]，它在有机化学、分析化学、生物化学的基础上迅速发展。探讨天然产物的收稿日期：2013-03-05；修改稿日期：2013-04-09。基金项目：国家自然科学基金（21276165）及教育部博士点专项基金（20120181110078）项目。第一作者：曾维才（1986—），男，博士研究生。联系人：石碧，教授，博士生导师，中国工程院院士。[e-mail]。特约评述化工进展2013年第32卷·1206·生物活性及构效关系[6]与生物、医药、食品等学科密切联系，已成为化学学科中重要且富有活力的研究领域[7]。统计显示，2002—2012年SCI（ScienceCitationIndex）收录的科学论文中约8万篇的研究主题是天然产物，占同期化学领域论文总数的6%。天然产物因成分复杂而具有多种多样的生物活性，其中，基于抗氧化活性的研究是天然产物领域研究的热点。对2002—2012年天然产物领域的SCI论文进行统计，约10%是关于天然产物抗氧化活性的研究。20世纪50年代，Harman提出“自由基氧化衰老”学说，认为生物体内的多种代谢途径都会产生具有高度氧化活性的自由基。体内自由基代谢平衡时，产生的自由基会被机体清除，当代谢处于不平衡状态时，过量的自由基便会攻击蛋白质、脂类、核酸等生物大分子，破坏细胞及组织器官，引起氧化损伤（图1），导致和加速机体衰老，并诱发各种慢性疾病[8]。研究还发现，自由基可引发食品的链式氧化，加速食品的腐败变质，带来严重的食品安全隐患，影响人体健康[9]。为了有效地预防和控制自由基氧化损伤给人体带来的危害，丁基羟基茴香醚（BHA）、2,6-二叔丁基对甲苯酚（BHT）、叔丁基对苯二酚（TBHQ）等化学合成抗氧化剂被广泛应用[10]。但随着公众对其潜在负面效应及安全性的认识，这类化学合成抗氧化剂的使用逐渐被限制或禁止，研究者开始转向从天然产物中制取高效无毒的抗氧化剂[11]。在寻找天然抗氧化剂的研究中，通过抗氧化活性评价，筛选出有益人体健康的化合物，是经典的研究思路[12]。整个研究中，对天然产物抗氧化活性的评价是核心和基础，对后续研究有重要的指导意义。不同评价方法的实验原理、适用范围各不相同，所得结果也有差异。要准确全面地考察天然产物的抗氧化活性，需同时采用多种评价方法。本文对天然产物抗氧化活性常见评价方法的原理、体系及优图1自由基在体内的代谢及对生物体的危害缺点进行归纳总结，以期为相关领域的研究人员进行快速、准确的实验测试提供参考。1体外抗氧化评价方法1.1化学分析法化学分析法主要通过化学方法测定天然产物对自由基的清除能力或对脂类物质氧化的抑制能力，从而评价天然产物的抗氧化活性。1.1.1ABTS自由基阳离子清除实验ABTS[2,2'-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，2,2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐]自由基阳离子清除实验是根据不同浓度受试物对ABTS自由基阳离子溶液吸光度的影响测定天然产物对ABTS自由基阳离子的清除能力，该方法最早由Miller提出[13]，经Re等[14]改进后被广泛用于天然产物抗氧化活性的测试。在Trolox（维生素E的水溶性类似物）被当作标准物用于实验测试时，此方法又称为TEAC（troloxequivalentantioxidantcapacity）法[13]。实验中，ABTS在氧化剂的过氧化作用下形成一种亚稳态的自由基阳离子，见图2，该物质易溶于水和酸性乙醇溶液，于415nm、660nm、734nm、820nm波长处均有吸收。在抗氧化物质的作用下，ABTS自由基阳离子被部分清除，溶液吸光度降低，通过与空白组实验结果的比较，得到受试物对ABTS自由基阳离子的清除效果。图2ABTS自由基阳离子的化学结构常用实验方法如下：用纯水配制含ABTS（7mmol/L）与过硫酸钾（2.45mmol/L）的混合溶液，置于23℃的暗处孵育12～16h，制备ABTS自由基阳离子基液。用纯水稀释基液至其在波长734nm处吸光度为0.700±0.005，得ABTS自由基阳离子工作液。取0.1mL不同浓度受试物溶液同3.9mL工作液混合，23℃孵育6min，测量反应混合物在734nm处的吸光度，纯水做空白对照[15]。计算方法如式（1）。ABTS自由基阳离子清除率（%）=（1-实验组吸光度空白组吸光度）×100%（1）第6期曾维才等：天然产物抗氧化活性的常见评价方法·1207·ABTS自由基阳离子在水及醇溶剂中均有较好的溶解性，可用于水溶性及脂溶性天然产物抗氧化活性的测定。该方法简单快捷，无需复杂的反应步骤及苛刻的反应条件，可测定酸性、中性及弱碱性化合物的自由基清除能力。同时，该方法也避免了受试物中含有的过氧化物对ABTS自由基的影响，能准确测定多成分混合物的抗氧化能力，故较多用于天然产物抗氧化活性的评价[16-18]。该方法的缺点是反应时间对该方法的测定结果有影响，不同的反应时间所得测试结果差异明显。其次，该方法不能真实反映活性物质在生物体内的抗氧化能力，也不能表征不同物质间抗氧化反应速度的差异。1.1.2DPPH自由基清除实验DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）是一种在氮氮连接键上含有不对称价电子的氮族自由基（图3），它能稳定存在，于517nm处有最大吸收值，易与具有氢键供体的化合物发生电子转移反应[19]。DPPH自由基清除实验中，受试物给出的氢原子与DPPH自由基结合，使反应溶液的吸光度发生变化，通过比较实验组与空白组溶液吸光度的变化评价受试物的抗氧化活性[20]。此方法最早由Blois提出[21]，后经大量实验改进，已成为评价天然产物抗氧化活性的一种常用方法[22]。图3DPPH自由基的化学结构常用实验方法如下：以95%的乙醇为溶剂配制浓度为0.1mmol/L的DPPH自由基溶液，此溶液需现配现用。取2.0mL不同浓度的受试物溶液同2.0mLDPPH溶液混合，25℃避光孵育30min，于517nm处测定反应溶液的吸光度，95%乙醇做空白对照[23]。计算方法如式（2）。DPPH自由基清除率（%）=（1-实验组吸光度空白组吸光度）×100%（2）采用DPPH自由基清除实验测定物质的抗氧化活性是一种简单有效、经济可靠的方法，其结果重复性好，受环境因素影响较小[24]。同其它测试方法相比，该方法所用自由基稳定，灵敏度高，无需其它复杂反应，可与色谱分离法结合，用于天然产物抗氧化活性的在线检测[25]。但是DPPH自由基仅溶于有机溶剂，对路易斯碱或溶剂敏感，在光照的富氧环境中易分解，易与烷基类自由基发生反应，在乳液体系及蛋白质体系的使用也受到限制[26-28]。此外，因受试物本身所具有的颜色对测定结果有较大影响，该方法也不适用于颜色较深样品的抗氧化能力测定[29]。1.1.3超氧阴离子自由基清除实验超氧阴离子（O2·−）是需氧细胞线粒体内电子转移产生的一种自由基[30]。它由氧分子接收一个电子形成，同生物体内其它活性氧自由基的产生有密切联系（图4）[31]。超氧阴离子在生物体内可长时间攻击靶向目标，对细胞有较强的氧化毒性，与人体的衰老及癌症等疾病的发生有关[32]。许多实验体系均可用于模拟细胞内超氧阴离子自由基的产生及清除，其中邻苯三酚法使用最为普遍。邻苯三酚在碱性环境中发生自氧化链式反应并释放出大量的超氧阴离子，超氧阴离子又进一步加速邻苯三酚的氧化，生成一系列在可见光区有特征吸收的中间产物。在反应体系中加入抗氧化物质可降低邻苯三酚的自氧化速率，清除产生的超氧阴离子，抑制中间产物的生成，使反应溶液的吸光度减小。通过比较实验组与空白组邻苯三酚的自氧化速率评价受试物的抗氧化能力[33]。图4超氧阴离子的产生常用实验方法如下[34]。邻苯三酚自氧化速率的测定