第六章-卫生指标细菌的检验

第一节食品中菌落总数的测定第二节食品大肠菌群计数第三节食品中粪大肠菌群计数第四节食品中大肠杆菌计数第一节食品中菌落总数的测定菌落总数食品中细菌数量越多，则食品腐败变质的速度就越快，甚至可引起食用者的不良反应。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。菌落总数在食品卫生质量评价中的意义1）食品中细菌数量可反映该食品被污染的程度新鲜的食品内部一般是没有或很少有细菌的，但由于外界污染情况不同，食品被细菌污染的多少就有所不同。食品中细菌数量越多，说明被污染的程度就越严重，越不新鲜，对人体健康威胁越大。相反，食品中菌数越少，说明该食品被污染的程度越轻，食品卫生质量越好，对人体健康影响也越小。2）食品中细菌数量可预测食品耐放程度和时间一般讲，细菌数越少，食品耐放时间越长；相反，食品耐放时间就越短，例如用0℃保存牛肉，菌落总数为103cfu／cm2时，可保存18天，而当菌落总数增至l05cfu／cm2时则只能保存7天。另外，用0℃保存鱼时，菌落总数为105cfu／cm2时可保存6天．而菌落总数在103cfu／cm2时则可保存12天。3）食品中细菌数量可估测出食品腐败状况一般认为日常食品的活菌数为104～107cfu／g。而当活菌数达到108cfu／g则可认为处于初期腐败阶段。例如，活的家禽，皮肤表面的细菌数可低到1.5×103cfu／cm2。而加工后马上检测可达3.5×104cfu／cm2。当菌落数为107cfu/cm2时表示确已经腐败，鸡肉的细菌数达108cfu／cm2时可有气味并变粘。一般讲，食品中细菌数量越多，则会加速腐败变质过程的进程，甚至可能引起食用者的不良反应。食品中细菌数量的表示方法细菌总数，也称细菌直接显微镜数。通常以1g或1mL或lcm2——样品中的细菌总数来表示。菌落总数：菌落：指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。检测：指一定数量或面积的食品样品，在一定条件下进行细菌培养，使每一个活菌只能形成一个肉眼可见的菌落，然后进行菌落计数所得的菌落数量。通常以lg或1mL或lcm2样品中所含的菌落数量来表示。细菌菌落总数按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在平板计数琼脂上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，仅是需氧菌和兼性厌氧菌数。细菌菌落总数检验GB4789.2-2010检样↓选取几个适当倍数的稀释液↓每皿加入约15-20mL平板计数琼脂（PCA）36±1℃48±2h↓菌落计数↓报告第一法实验材料1、电热恒温培养箱、冰箱、恒温水浴锅、天平、电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、试管、试管架、微量移液器、酒精灯、均质器或乳钵、灭菌刀或剪刀、灭菌镊子、75%酒精棉球、油性笔、登记薄2、培养基和试剂：75%乙醇、生理盐水（磷酸缓冲液）、1mol/mL氢氧化钠溶液、1mol/mL盐酸溶液、平板计数琼脂培养基、petrifilm纸片和压板，检验方法。PCA与NA样品的处理样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。必要时可调解pH值至中性。无菌操作：所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。琼脂平板在操作的工作台暴露30分钟，每个平板不得超过2个菌落。采样的代表性：多点取样、均质或研磨、振摇等方法处理，以获得均匀稀释液。稀释程序25g倾注培养根据标准要求或对污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。对照空白对照：不加样品，反应培养基中的杂质及污染情况稀释液对照：加1mL无菌稀释液，反映稀释液是否受到污染样品对照：加1mL样品稀释液后放冰箱，以区别样品中的杂质无菌操作对照：在空气中暴露30min，反应空气质量和操作技术洁净级别标准超净工作台，要求100级；无菌室空间，要求1万级。倾注培养基倾注培养基一般以15ml较为适宜，平板过厚影响观察，太薄易干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。如预计样品中存在会在PCA上形成蔓延菌落，可在培养基凝固后在加入约4mL培养基，凝固后再翻转平板。培养培养基凝固后倒置培养。培养温度一般为36±1℃（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用30±1℃）。培养时间一般为48h(水产品72±3h)。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养48h后，培养基失重不应超过15％。为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，于4℃环境中放置，以便计数时作对照观察。或在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。平板菌落数的选择@选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定标准。@一个稀释度使用两个平板，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。@平皿内如有链状菌落生长时(菌落之间无明显界线)，若仅有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。@当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。菌落计算公式有两个稀释度的菌落数在合适范围的情况下，使用菌落计算公式。例一例二菌落计算公式的统计学依据报告方法按国家标准方法规定菌落数在1－100时，按实有数字报告；如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。后面用0来代替位数，或采用10的指数方式表示,保留2位有效数字。若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。若空白对照上面有菌落生长，则此次检验结果无效。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm2）报告。2019/10/17菌落计数的重复性要求（ISO4833:2003）菌落计数的重现性要求（ISO4833:2003）菌落总数的其它检验方法菌落总数PetrifilmTM测试纸片法检验流程：与国标法同，只是将培养基更换为PetrifilmTM菌落总数测试纸片调节PH：样品匀液后，用1mol/mL氢氧化钠溶液或1mol/mL盐酸溶液调节至pH6.6～7.2。稀释：按照国标法进行。接种测试纸片平放台面，揭开上层膜，用吸管或移液器吸取1mL样品匀液，垂直加在纸片中央，盖膜，压板，拿去压板，静置1min，待培养基凝固后，每个稀释度接种2张测试纸片。菌落总数PetrifilmTM测试纸片法培养：水平放置，透明面向上，每堆低于20片，其他与第一法同。计数：选取菌落数在30～300之间的测试纸片计数；计数所有红色菌落；整个纸片为红色和粉红色，或是纸片中央无菌落，边缘很多，均记录为“多不可计”；培养基液化，可计算未液化面积来估算菌数。多不可计菌落总数的其它检验方法涂布平板法：将营养琼脂制成平板，在上面滴加检样稀释液0.2ml，用“L”棒涂布于整个平板的表现，放置约10分钟，将平板翻转，放至36±1℃温箱内培养24±2小时，（水产品用30C培养48±2小时)取出，进行菌落计数，然后乘以5(由0．2ml换算为1ml)，再乘以样品稀释液的倍数，即得每克或每升检样所含菌落数。特点：因为菌落生长在表面，便于识别和检查其形态，虽检样中含有食品颗粒，也不会发生混淆．但是本法取样量比常规检验法少。代表性会受到一定影响。菌落总数的其它检验方法点滴平板法：用标定好的微量吸管或注射器针头按滴(使每滴相当于0．025m1)将检样稀释液滴加于琼脂平板上固定的区域(预先在乎板背面用标记笔划成四个区域)．每个区域滴1滴，每个稀释度滴两个区域，作为平行试验。滴加后，将平板放平约10分钟，然后翻转平板，如涂布平板法+样移入温箱中，培养6—8小时后进行计数，将所得菌落数乘以40(由0．025m1换算为1ml)，再乘以样品的稀释倍数，即得每克或每毫升检样所含菌落数。特点：与涂布平板法相似。螺旋平板法3.4空气监测和表面样品空气监测：3点5点9点室内面积不超过30m2，在对角线上设里、中、外三点，里、外点位置距墙1m；室内面积超过30m2，设东、西、南、北、中5点，周围4点距墙1m。采样时，将含营养琼脂的平皿（直径9cm）置采样点（约桌面高度），打开平皿盖，使平皿在空气中暴露5min。表面样品：工作台：将经灭菌的内径为5cm×5cm的灭菌规格板放在被检物体表面，用一浸有灭菌生理盐水的棉签在其内涂抹10次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的采样管内送检。菌落总数的测定－－平板菌落计数法菌落计数报告例次不同稀释度的平均菌落数菌落总平均数及报告方式（个/ml，或个/g）10-110-210-3两个稀释度菌落数之比1146817420－17400或1.7×1042多不可计29546460/295＝1.637750或3.8×1043多不可计27160600/271＝2.227100或2.7×1044多不可计1550511－511000或5.1×105528107－280或2.8×1026000－1×10或107多不可计30318－30300或或3.0×104菌落总数的测定－－平板菌落计数法菌落总数记录报告产品名称生产车间班次生产日期抽样日期检验日期细菌总数检验依据培养基接种营养琼脂培养基结果报告数（个/g或ml）AB平均数110-110-210-310-410-5空白备注检验员：日期：复核：日期：菌落总数的测定－－平板菌落计数法注意事项检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。充气饮料应在无菌条件下进行排气；酸性样品用经过灭菌的20～30％碳酸钠溶液调整pH值至中性；高盐样品应用灭菌蒸馏水进行稀释。在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液面2.5cm；吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸；当用吸管将检样稀释液加至另一装有9mL空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。为了防止细菌增殖及产生片状菌落，在检液加入平皿后，应在20分钟内向皿内倾入琼脂，并立即使其与琼脂混和均匀。计数表示方法：CFU/ml或个（国际标准）菌落总数的测定－－其他菌落总数的测定平板菌落计数法测定的是在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧或兼性厌氧的菌落总数。厌氧菌、嗜冷菌、嗜热菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制。嗜冷菌计数（新鲜鱼贝）操作要点：采样后尽快冷藏检验；稀释液涂布于TS或CVT