PCR技术简介-PPT课件

PCR技术简介主要内容PCRRT-PCR（reversetranscriptional-PCR）琼脂糖凝胶电泳PCR的概念PCR（polymerasechainreaction）即聚合酶链反应技术，它是以待扩增的两条DNA链为模板，在一对人工合成的寡核苷酸引物的介导下，利用耐热DNA聚合酶的酶促作用，通过变性-复性-延伸的循环操作，快速特异地扩增出特定的DNA片断。DNA的复制核酸体外扩增的设想1985年Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后诞生了第一台PCR自动化热循环仪1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖PCR技术简史PCR的原理PCR反应时，一般采用变性-复性-延伸三步循环。1．变性：通常采用加热变性，即将模板DNA或延伸后的双链DNA加热到940C，使双螺旋DNA解开成为单链。2．复性（退火）：通过降低反应温度至45-700C，使两种引物能与两条解开的DNA互补链的3`端粘合。PCR的原理PCR的主要用途目的基因的克隆基因的体外突变生成大量DNA以进行序列测定特异基因表达量分析PCR反应体系20ul；25ul；50ul浓度50ul体系(ul）10×PCRBuffer5Mg2+1.5mmol/L4dNTPs200umol/L4引物110pmol2引物210pmol2模板0.1～2ug1Taq酶2.5u0.5ddH2O31.5PCR实验准备—试剂Taq酶0.5-2.5U/50l（通常2.5U/50l）酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量从生物公司购买：生工；华美；Takara;Promega;与buffer,mg2+成套出售Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂1.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系（通常4l/50l）Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性PCR实验准备—试剂PCR实验准备—试剂Buffer提供合适的PH值有10×buffer和2×buffer有的buffer中含有mg2+，有的buffer中不含有mg2+PCR实验准备—试剂dNTPdATP，dTTP，dGTP，dCTP可以购买dNTP混合液，也可以购买dATP，dTTP，dGTP，dCTP等体积混合四种dNTP浓度应相等每种200umol/L（通常4l/50l）浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量PCR实验准备—试剂模板（DNA或cDNA）单、双链DNA均可不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类一般50ngDNA模板/50L模板浓度过高会导致反应的非特异性增加提取细胞或组织中的基因组DNAPCR实验准备—试剂ddH2O灭菌的去离子水或双蒸水PCR实验准备—试剂引物0.1-0.5mol/L（通常10pmol的引物2ul/50ul）浓度过高易导致模板与引物错配，反应特异性下降利用软件（Omiga、Primerprimier）设计引物后，由生物公司（生工、赛百盛）合成，收到合成完毕的引物后根据说明对引物进行稀释，一般稀释成10pmol使用引物设计中需关注的有上下游引物之间的长度，即将来PCR产物的大小；以及上下游引物的Tm值，即将来PCR中的退火温度PCR实验准备--试剂引物设计原则：1.长度以15－30个碱基为宜2.正向反向两条引物链之间的距离适中，一般使扩增出的片断在300-1100bp之间。如果使用RT-PCR检测RNA病毒，引物间距离以500bp最佳。片断过短影响结果判定，过长则不易扩增3.引物碱基组成应随机分布，G+C含量在45-55％为宜。过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大4.引物自身不形成二级结构，引物间没有互补序列（4个碱基以上），引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败5.引物序列具有特异性6.引物3`端碱基与模板DNA一定要配对，并且3`末端碱基最好选T、C或者G，不选A。因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高PCR实验准备--仪器、耗材PCR仪移液器吸头200ulPCR管EP管架枪头盒PCR板冰盒1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR反应程序PCR反应程序预变性(94C,3m)变性(94C,30s)复性(50-70C,30s)延伸(72C,30-60s)总延伸(72C,10m)(25-35)变性温度:94˚Cor95˚C,不变；延伸温度：72˚C，不变；退火温度：50˚C左右，可变，Tm值-5延伸时间：30-60s，与PCR产物的大小有关，参考酶的延伸效率（通常1000bp/min）PCR反应程序(1)94℃变性3min，(2)94℃变性30sec，(3)52℃退火30sec，(4)72℃延伸1min。(5)goto(2)repeat29,（6）72℃延伸10min。（7）holdat4℃。PCR操作过程加样顺序50ul体系(ul）10×PCRBuffer5Mg2+34dNTPs44引物152引物262模板71Taq酶80.5ddH2O131.52混匀，瞬时离心3-5secPCR操作过程PCR操作过程RT-PCR（reversetranscriptional-PCR）RT-PCR原理DNA聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增RT-PCR主要用途检测特异基因的表达量特异基因的组织定位构建cDNA文库鉴定已转录序列是否发生突变RT-PCR反应体系10×buffer2ulMg2+4uldNTP2ulRnaseInhibitor0.4ulAMVRnaseXL0.4ulAMV-Taq0.4ulH2O3.8ul引物Ⅰ1ul引物Ⅱ1ulRNA(≤1ug)5ul一步法RT-PCRRT-PCR反应体系ComponentsVolume(µl)RNA8(1µg)5xR.T.buffer4dNTPs(10mmol/L)2Primer1Rnasin(50U/µl)0.4AMV-RT((10U/µl)1.0DEPC-H2O3.6Total20两步法RT-PCRComponentsVolume(µlR.T.Product5.010xPCRbuffer2.5MgCl2(25mmol/L)2.5Primer11Primer21TaqDNApolymerase1ddH2O12Total25cDNAPCR扩增cDNA第一链合成反应RT-PCR的准备--试剂提取细胞或组织中RNA购买RT-PCR试剂盒（一步法或两步法）RT-PCR的准备--耗材、仪器超净台PCR仪移液器吸头200ulPCR管EP管架枪头盒PCR板冰盒RT-PCR过程中cDNA第一链合成反应所用的枪头、枪头盒、PCR管等塑料制品均提前用氯仿进行处理，高压灭菌后使用。玻璃制品在180℃干烤6-8小时。加样过程在超净台内进行，需戴手套与口罩。cDNAPCR扩增的准备工作同普通PCR反应。RT-PCR反应程序(1)42℃30min，(2)94℃3min，(3)94℃变性3min，(4)94℃变性30sec，(5)52℃退火30sec，(6)72℃延伸1min。(7)goto(4)repeat29,（8）72℃延伸10min。（9）holdat4℃。RT-PCR操作过程cDNA第一链合成反应所用枪头、枪头盒、PCR管等塑料制品均提前用氯仿进行处理，高压灭菌后使用。玻璃制品在180℃干烤6-8小时。在超净台内按试剂盒说明书进行加样，加样过程需戴手套与口罩。cDNAPCR扩增的准备工作同普通PCR反应。在PCR仪上设定程序进行反应。琼脂糖凝胶电泳的原理琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定核酸片段的有效方法，琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，利用电荷效应，在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下，带负电的核酸分子向正极迁移。利用分子筛效应可以分离不同片断大小和不同构象的DNA、RNA分子。琼脂糖凝胶电泳的主要用途分离不同片断大小和不同构象的DNA、RNA分子。鉴定DNA片段，如PCR产物的鉴定。纯化DNA分子。琼脂糖凝胶电泳的准备--试剂琼脂糖电泳缓冲液：Tris，冰乙酸，EDTA（TAE）6X载样缓冲液（Loadbuffer）：溴酚蓝，蔗糖染色液：goldviewDNA或RNA样品DNA分子量marker琼脂糖凝胶电泳的准备--仪器、耗材电泳仪电泳槽微波炉三角瓶移液器电子天平枪头凝胶成像系统琼脂糖凝胶电泳的操作过程1g琼脂糖加入100ml1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60℃，加入5μl的goldview，并摇匀。）装好制胶板，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。充分凝固后，小心垂直向上拔出梳子，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm。琼脂糖凝胶电泳的操作过程用移液器吸取PCR产物10μl于封口膜上，再加入2μl的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。打开电源开关，调节电压至50-100V，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。将凝胶置于凝胶成像系统，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。琼脂糖凝胶电泳的操作过程琼脂糖凝胶电泳的注意事项配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围