动物实验基本方法

动物实验技术万筱荣实验动物基本概念实验动物定义：经人工培育和人工改造,对其携带的微生物和寄生虫实行控制、遗传背景明确或者来源清楚，而用于科学研究、教学、生物制品或药品生产、鉴定以及其它科学实验的动物实验动物分类按遗传学分类：近交系、封闭群、杂交群。按微生物学分类：普通级动物、清洁级动物、无特定病原体动物、无菌动物普通级动物：不携带主要人畜共患病病原和动物烈性传染病的病原。清洁级动物：除普通动物应排除的病原外，不携带对动物危害大和对科学研究干扰大的病原。无特定病原体动物：除清洁级动物应排除的病原外，不携带主要潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的病原。无菌动物：无可检出的一切生命体。、实验动物的饲养和使用应遵守国家有关的法律和规定。2、应明确使用实验动物的理由和目的。3、明确实验所使用动物的种类和数量，动物的数量应满足统计学的要求。4、完善操作规程，避免或减轻因实验对动物造成的不适和痛苦。包括使用适当的镇静、镇痛或麻醉方法；禁止不必要的重复。、严格按程序实施实验后动物的处理，包括麻醉、止痛、实验后的护理或用麻醉方法处死。6、实验过程中要求保证实验动物的良好生活条件，包括饲养环境、符合需求的饲料及细心的护理等。7、研究人员和实验动物操作人员应接受实验动物的基本知识和操作技能等方面的培训。8、使用过程中要求保证周围环境和实验人员的安全。、物理限制2、手术操作3、饮食的限制4、废弃物和尸体处理物理限制：是指在实验过程中（包括检查、收集标本、给药、治疗或实验操作等），用手或工具限制动物活动的过程。根据实验内容不同，限制时间有差异，但要求尽量缩短限制时间。有些动物，如狗和灵长类动物可以通过简单的训练达到目的.物理限制的主要原则和要求包括：限制的工具不能作为常规的饲养工具。工具的设计应合理，不要仅考虑实验的便利，主要考虑尽量减少动物的不适，避免伤害。尽量减少限制的时间，以达到实验目的为基准。在限制过程中，如果发生损伤或严重的行为改变，应暂停或禁止限制，并给予处理或治疗。保证实验人员和周围人员的安全。手术操作有些实验需要对动物进行手术，即打开或刺穿动物的身体，对动物的物理或生理机能产生较大的损害，同时，实验人员也容易被血液/体液污染或被器械、针头刺伤，存在潜在生物污染的威胁，因此必须做到：操作一定要使用适当的镇静、镇痛或麻醉方法。禁止不必要的重复操作。不提倡利用一个动物进行多个手术实验，但是，为充分利用动物资源，经动物伦理委员会许可，在可能的条件下可以实施。严格实验操作规程，防止发生血液/体液外溅和针刺伤，避免生物污染。手术后的动物、标本以及所用器具材料等必须按规定程序妥善处置。饮食的限制实验用动物原则上要求随时饮食，如果一些实验需要动物限制食物或水的摄入量，应保证动物存活所需要的最低需求量。根据研究的目的，食物的限量应经过科学的论证，其限量的标准应容易操作，如正常摄入量的百分比或动物体重的百分比。对于水分的限量摄入，一定要防止动物发生脱水现象，并要保持动物的膳食平衡。．动物尸体的处理安乐处死后的动物尸体，取材完毕后，经121℃30min高压灭菌处理后，集中送环保部门处理。动物生物安全三级（animalbiosafetylevel3,ABSL-3）实验室及以上级的实验室的感染动物尸体需经室内和双扉两道高压灭菌，才能移出实验室。2.动物咽拭子的处理用于病原分离和PCR检测的咽拭子，按照各自的要求处理后，进行病毒分离和PCR检测，剩余的标本经121℃，30min高压消毒处理。3.病原分离培养物的处理病原分离的培养物，不论是阳性还是阴性结果，均需经121℃，30min高压消毒处理。选择实验动物基本原则尽量选择研究对象的功能、代谢、结构及疾病与人类相似的动物；解剖、生理特点符合实验目的要求；实验动物不同品种品系的特点；选择标准化实验动物；符合实验动物选择的一般原则；经济性原则；要考虑到动物实验结果的外推；注意有关国际规范。动物实验基本技术实验动物的抓取、保定与给药1实验动物的编号和分组2实验动物的麻醉34实验动物的采血大鼠豚鼠家兔犬一、抓取、保定与给药小鼠•小鼠的捉持1、用右手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部将小鼠提起，放在饲养合的面罩上。用左手拇指和食指迅速、准确地捏住小鼠的两耳后及颈背部的皮肤，将小鼠提起。翻转左手掌，以左手掌心和中指夹小鼠背部的皮肤，使小鼠整个呈一条直线。用左手拇指和食指迅速、准确地捏住小鼠的两耳后及颈背部的皮肤，将小鼠提起。•大鼠的捉持首先戴好防护手套用右手拇指和食指抓住大鼠尾巴中部将大鼠提起，放在大鼠饲养盒的面罩上。左手顺势按、卡在大鼠躯干背部，稍加压力向头颈部滑行。以左手拇指和食指捏住大鼠两耳后部的头颈皮肤，其余三指和手掌握住大鼠背部皮肤，完成抓取固定。•豚鼠的捉持先用左手轻轻扣、按住豚鼠背部。顺势抓紧其肩胛上方皮肤，拇指和食指环箍其颈部。用右手轻轻托住其臀部，即可将豚鼠抓取固定。•兔的捉持用右手抓住兔颈部的被毛和皮肤，轻轻把兔提起。用左手托住兔的臀部家兔的固定方式有腹卧式和仰卧式两种•犬的捉持实验者先抚摩，逐步接近，勿使其惊恐或将其激怒。用粗棉绳兜住狗的下颌，并在上颌打结（勿太紧）。如犬不合作，则先用一根特制长柄狗头夹，从后面夹住犬颈，限制犬头部活动，再按上述方法捆住犬嘴。实验动物的捉拿.MPG•灌胃给药——大小鼠1、将灌胃针连接在注射器上，吸入一定量的药液。左手捉持动物，使头部向上。右手持针，把灌胃针头的前端放进动物的口腔，顺着上腭部插入咽部，顺咽后壁轻轻往下推。用右手食指将针栓慢慢往下压，将注射器中的药液灌入动物的胃中。剂量：小鼠约0.1-0.5ml／10g体重。最大体积为1.0ml/只大鼠约1-2ml／100g体重，最大体积为5.0ml/只•灌胃给药——兔将兔放进固定架内，灌胃者用左手拇指和中指挤压兔两颊，将下颌挤开使兔被动张口。右手将开口器从一侧口角插入口腔并固定。胃管经开口器的孔插入，向前推进约15cm，可达胃内。在插管时应将胃管另一端泡在水中确认没有冒气泡，即可用注射器经胃管注入药液。豚鼠灌胃同家兔•皮下注射给药——大小鼠颈背部、腋下、腹侧和后肢的皮下注射针头取一锐角角度刺入皮下。将针头轻轻向左右摆动，易摆动则表示已刺入皮下。再轻轻抽吸，如无回血，可缓慢地将药物注入皮下•静脉注射给药——大小鼠将大小鼠放在金属笼或小鼠固定器中，通过金属笼或大小鼠固定器的孔拉出鼠尾巴用左手捏住鼠尾巴中下部，用75％酒精棉球反复擦拭尾部注射时，以左手拇指和中指捏住鼠尾两侧，用食指从下面托起尾，右手持4号针头的注射器，使针头与静脉平行（小于30度角）大鼠亦可用舌下静脉注射•静脉注射给药——犬前肢皮下头静脉或后肢小隐静脉注射。先将注射部位毛剪去。在静脉血管的近心端，用乳胶管扎紧肢体，使血管充盈，注射器针头向静脉血管的近心端方向穿刺。回抽注射器针栓，如有回血，则证明针尖在血管内，即可推注药液。•静脉注射给药——兔兔放在固定架内，酒精消毒并揉搓血管，使兔的耳缘静脉充盈。用左手食指和中指夹住兔的耳缘静脉的近端，拇指绷紧静脉的远端，无名指和小指放在耳郭下作垫。右手拿注射器，针尖的斜面朝上，将针头从远心端插入血管回抽有血即可注射，拔针后用棉球止血豚鼠可用足背静脉注射实验动物的给药.MPG不同种类实验动物一次给药能耐受的最大容量（ml）动物名称灌胃皮内注射皮下注射肌肉注射腹腔注射静脉注射小鼠1.00.11.50.210.8大鼠5.00.15.00.524.0兔1000.2102.0510猫1500.2102.0510猴3000.3503.01020犬2500.31004.0--100人与动物用药量换算一般可按下列比例换算：人用药量为1，小鼠、大鼠为25-50倍，兔、豚鼠为15-20倍，犬猫为5-10倍。此外，可以采用人与动物的体表面积计算法来换算。二、实验动物的采血5231尾尖采血眼眶静脉丛采血断头采血腹主动脉采血4心脏采血腹主动脉采血6静脉采血方法：固定动物并露出鼠尾，将尾部在45℃的温水中浸泡数分钟（或以二甲苯棉球涂擦），使尾部血管扩张。将鼠尾擦干，用锐器切去尾尖0.3～0.5cm，让血液滴入盛器或直接以血红蛋白吸管吸取。对象：大、小鼠特点：小量采血，可以多次采血。1尾尖采血方法：用左手捉鼠，拇指及中指抓住头颈部皮肤，食指按于眼后，使眼球轻度突出，眼底球后静脉丛淤血。右手持取内径为1.0-1.5mm的玻璃毛细管（临用前折断成1-1.5cm长的毛细管段，浸入1％肝素溶液中，干燥后用）刺入深度小鼠2～3mm，大鼠4～5mm。当感到有阻力时再稍后退，得到所需要的血量后，拔出。对象：大、小鼠等。特点：中等血量（0.2～0.3ml，小鼠；0.5～1.0ml，大白鼠），避免动物死亡。2眼眶静脉丛采血方法：左手以拇指和食指保持动物的头颈部，使其头略下倾，右手持剪刀猛力剪断鼠颈，让血液滴入盛器。对象：大、小鼠等。特点：需要血量较大（小白鼠可采血0.8～1.0ml，大白鼠可采血5.0～8.0ml），且不需要继续保存动物生命时用本法。3断头采血方法：动物要麻醉后进行，用针管在腹主动脉分叉处，与血管平行刺入。对象：大、小鼠等。特点：需要血量较大，且不需要继续保存动物生命时用本法。4腹主动脉采血方法：将动物背位固定，在左胸第2至第4肋间剪毛一块，用碘酒和酒精消毒。然后用配有7号针头的10ml注射器，在心跳最明显处作穿刺。针头刺入心脏后即见血液流入注射器；或边刺边抽，直至血液流入注射器。取得所需血量后，迅速将针头拔出，这样心肌上的穿刺孔较易闭合。对象：兔、豚鼠等。特点：采血量较大，继续保存动物生命。5心脏采血方法：将家兔放在固定箱内，剪去拟采血耳壳上的毛，用电灯照射加热或用二甲苯棉球涂擦耳壳，使耳部血管扩张。用粗针头刺破耳缘静脉或以刀片在血管上切一小口，让血液自然流出，滴入已放有抗凝剂的盛器中。采血完毕，用干棉球压住出血口，以待止血。如一时不易止血，可用木夹夹住耳壳10～20分钟。对象：犬——在前肢静脉、后肢小隐静脉采血；小型猪——为耳大静脉、后肢静脉特点：采血量较大，继续保存动物生命。6静脉采血三、实验动物被毛去除方法拔毛法：用拇指和食指拔去被毛的方法剪毛法：用剪刀紧贴皮肤剪去被毛剃毛法：用剃毛刀剃去动物被毛。脱毛法：用化学药品脱去动物被毛。