第四章-生物制品生

第四章生物制品生产基本技术第一节菌种与毒种选育技术一、生物制品毒种的标准1.生物学性状明显，历史清楚：形态、生理、生化典型、血清学、来源、代数等清楚。2.遗传学纯一稳定：稳定纯一的菌种，才能制造出高质量稳定的疫苗。3.免疫抗原、反应抗原好：高质量疫苗的基础。4.毒力在适当范围内：灭活疫苗应该是强毒，弱毒疫苗安全，中等毒力的如ND-I系，IBD中等毒力苗。测定毒力要用敏感动物进行。二、强毒种的选育1、强毒种的用途：灭活疫苗、诊断试剂、抗血清、攻毒试验。2、强毒种来源：典型传染病分离培养;保藏中心提供。3、强毒种分离：a、纯粹试验（分离培养、鉴定）。B、致病力（动物、鸡胚、细胞试验）。C、抗原性（免疫及反应抗原试验）D、稳定性（传代不变异）达到：毒力强，纯粹，抗原好，稳定的菌种，最后冻干保藏。这就是强毒菌种的标准复壮：弱毒菌种在敏感动物或细胞上多次传代，达到毒力增强的目的（日本731部队用人试验，目的是增强细菌毒力，做细菌武器使用。）。三、弱毒种的选育1、用途：弱毒疫苗，诊断试剂，免疫血清。2、来源：自然界筛选和人工诱变。3、弱毒筛选途径：自然界弱毒筛选：同源弱毒—新城疫I系异源弱毒—火鸡疱疹病毒疫苗，它们都是在自然界寻找发现的。人工诱变筛选：化学诱变：洗衣粉、锥黄素、醋酸铊等加入培养基。物理诱变：高温培养，干燥，紫外线等。生物诱变：通过钝感动物，细胞以及细胞培养获得。4、初选的依据：①生物性状改变—猪丹毒杆菌变长丝状，菌落光滑变粗糙。②病毒蚀斑变异。③温度敏感变异。④药物敏感变异⑤营养变异⑥宿主变异第三节细菌培养技术细菌培养技术是生物制品制造的基础，一些内容在微生物学已经学习过，这里主要讲一些重要的细菌培养技术。一、细菌生长规律与条件大家一定要熟悉细菌的生长曲线，因为不同的生物制品，要用不同时期的细菌，如细菌疫苗，要对数期或稳定期细菌；芽孢疫苗，要衰老期细菌；外毒素要老龄细菌。其次，要根据不同细菌用不同的培养基进行培养，用不同的培养方法（需要氧气，微需氧，厌氧。另培养温度，pH，渗透压等。）。二、细菌培养的基本技术步骤：先分离出单个菌落→斜面培养基→生化或血清鉴定→菌种保存→生产生物制品→先接种到斜面菌种→小三角瓶肉汤→大三角瓶肉汤。（一）细菌分离培养（目的是稀释病料，得到单个典型菌落）。1、需氧菌分离培养：分段划线、倾注培养。2、微需氧培养：鸭疫巴氏杆菌，牛布氏杆菌病，猪传染性胸膜肺炎菌等，用蜡烛缸方法。3、厌氧菌培养：用疱肉基，物理除氧气（加氮气，氢气），化学除氧：焦性没食子酸加烧碱。厌氧罐厌氧培养箱（二）细菌的规模培养生物制品是产品，一般要大规模培养，才能满足基层需要。1、菌种接种量：1-3%，过少生长慢，过度带入有害产物多，影响生长。2、培养时间：菌苗，对数期和稳定期的细菌好；芽孢疫苗：衰老期细菌；外毒素：需要1周时间培养。在培养过程中，如果有少量污染，可以提前灭活终止培养。②液体静止培养：一般细菌疫苗多用，用大三角瓶（5000ml）或发酵罐，装入培养基1/2—-2/3量，需氧培养，要5小时摇动一次，增加氧气浓度。培养厌氧细菌，可以装满培养基，上面加少量石蜡油，隔绝空气，下加肝块或肉渣（疱肉基），它们氧化，吸收氧气，达到除氧气目的。液体培养含菌量低，多需要浓缩。3、培养方法：根据不同制品的性质和要求，选育不同方法。①固体表面培养：多用于诊断剂，也有菌苗生产。可随意调节细菌浓度，但操作麻烦，劳动量大。培养方法有克氏瓶，大平皿，到入菌液，L玻棒刮抹接种，培养后加生理盐水，再用L棒刮洗下细菌混悬液。③液体深层通气培养（发酵罐）：可自动调节温度、氧气、pH、营养、搅拌，注意消泡沫和污染。④透析培养：半渗透膜作用，营养可以不断补充，可以提高细菌和毒素含量。⑤连续培养：营养不断加入，培养好的细菌不断流出。KRH-PB-6L玻璃发酵罐（三）细菌计数技术细菌疫苗必须有一定含菌量，才有好的免疫效果。所以，应该对生产的疫苗计算含菌量。1、直接显微镜检查计数①定量定面积染色计数：10ul菌液，涂抹1cm2面积的载玻片上，干燥固定染色，油镜下观察，油镜直径是0、16mm，视野面积是0、02mm2，1cm2面积有50万个油镜视野，多观察几个视野，算出一个视野细菌平均数X50万X100，即每ml含细菌量。②比例法计数（也叫对照法）如用已知人红细胞为500万/mm3（可以把红细胞0、4%甲醛固定，长期使用），取一环红细胞放在载玻片上，另取一环菌液与红细胞混匀涂片，干燥固定染色，显微镜下检查，如果平均每个视野是一个红细胞，10个细菌，那么，被检查细胞为5000万/mm3，，1ml是500000万个细菌。③估计计数法接种环直径在0、5cm，取一环细菌液，涂抹在载玻片上，大约0、5—1cm2，干燥固定染色，显微镜检查，如果每个视野平均是1—9个细菌，菌液含量是105-6个/ml，10—99为107-8个/ml，100以上为109-10个/ml，密不可计为1010个以上/ml。④红细胞计数室法：（细菌量）Y/80X400X稀释倍数X10=细菌数/mm3，变ml乘1000。（Y是5个中方格细菌总数，乘10是计数室的高度为0、1mm，计数室1mm2，有400个小格，有25个中格，每个中格是16个小格）。该方法多用于计数大的细菌或酵母菌、细胞。2、比浊比色法①比浊管法含菌量与浑浊度正比，用已知菌含量的试管与标准比浊管相比，找出规律，如1亿细菌=1号比浊管颜色，10亿等10号，以后，用未知细菌液与标准管比色，得出大致细菌含量。②美蓝还原褪色法：含细菌多，使美蓝褪色快。10ml牛奶，加1ml美蓝液（1/3000），37度水浴，褪色少于20分钟，细菌多于2000万/ml，20-2小时，为400—2000万；2----5、5小时为50—400万；5、5小时以上，为少于50万/ml，为一级牛奶；如果用于细菌苗，应先用已知细菌找出规律。3、活菌计数：原理，一个菌落是一个细菌的后代，数菌落就知道含菌量，也叫菌落形成单位—CFU：colonyformatunite。①倾注法（GB方法）：菌液10倍递减稀释，选2-3个稀释度，各取1ml于平皿，加45-50℃营养琼脂15-20ml，摇匀37度培养，计算菌落，乘稀释倍数，即每ml细菌数。②平板表面涂布法：先做好营养琼脂平板，将不同稀释度菌液0、1ml加上，玻璃棒刮匀，37度24h培养，计算菌落乘稀释度乘10=菌数/ml③微量滴板法：将不同稀释度菌液，各取0、02ml滴在营养琼脂板上，一板可以滴多点，自然扩散，37度培养，计算每点菌落乘50乘稀释度=菌数/ml。三、培养基微生物学已经学过，自己温习，重点熟悉：1.不同微生物用不同的培养基来培养2.注意各种营养物质浓度配比3.调节合适的pH范围第三节病毒的增殖技术一、病毒的复制与培养病毒为专性细胞寄生物，必须在活细胞内生存，其复制过程是：吸附，进入，脱壳，生物合成，装配和释放。微生物已经讲，自己复习。二、病毒的动物接种增殖（一）、病毒材料的处理1、病毒的释放：剪碎研磨，1：5-10稀释，冰冻融及超声波处理。2、除杂菌：细菌过滤器过滤，高速离心取上清液；其次是抗生素处理，加500—1000u/ml青霉素和链霉素，4度过夜杀菌。（二）动物选择健康动物、SPF动物；未接种相应病毒疫苗动物适宜年龄和体重易感动物。（三）接种方法：皮下，肌肉，静脉，腹腔，脑，胸腔等三、鸡胚的接种（一）鸡胚的选择1、健康的SPF鸡胚2、白壳，薄壳消毒蛋3、没免疫相应病毒疫苗4、5-7天照蛋，去无精、死胚鸡蛋5、画出气室，接种24h照蛋，定时收病毒。（二）鸡胚的接种和收获避开血管和心脏，确定接踵部位，先碘酒消毒，再酒精消毒，用三棱针或12号针头钻孔，然后可以接种。预先准备好病料，注射器，融化的石蜡。1、卵黄囊接种：用5-8天鸡胚，在气室中心，胚胎对侧刺入3cm（先用三棱针钻孔）。用于病毒，立克次氏体，衣原体接种。2、尿囊腔接种，用9-11日鸡胚，在气室边缘下2cm，避开血管，40°进针0、5-1、5cm。适应鸡新城疫，鸭肝炎，鸡传染支气管炎病毒接种。3、羊膜腔接种：用10-12日鸡胚，在胚胎对侧进针，有抵抗时注入病毒。4、绒毛尿囊膜接种：选11—13日鸡胚，先造人工气室，然后在人工气室内注射，适合痘病毒，疱疹病毒等。另外，还有脑，胚体，静脉接种，难度大，科研使用。不同病毒用不同接种途径，培养时间不同，收获组织也不同。（三）影响禽胚增殖病毒的因素1、种蛋质量：要用SPF蛋，母源抗体存在，抗生素（对立克次氏体和衣原体）。2、孵化环境：温度是37、8--38℃，湿度53-57%，通风，定时翻蛋。3、接种技术：无菌操作和消毒，收获根据不同病毒，收获病毒时间不同，不要臭蛋和浑浊蛋。收获后测效价，加双抗-20℃保存。四、细胞增殖病毒技术1、细胞培养概念：利用机械、酶、化学方法使组织或单层细胞分散成单个或2-4个细胞的悬液，进行培养。①原代细胞：新鲜组织制备的单细胞进行培养，一般仅可以传代3代。②二倍体细胞：自继代细胞选出的也特殊生物学标志的细胞，染色体是二倍体，可传代50-100代，主要做疫苗生产。③传代细胞：非二倍体，多为癌细胞，可无限生长，如Hela细胞，多用做病毒研究，不能做疫苗生产。2、细胞培养的方法①静止培养：细胞悬液接入培养瓶中，密封置温箱培养，细胞沿瓶子壁长成单层，为最简单培养病毒方法。②转瓶培养：细胞悬液在转瓶旋转培养，10-20转/h，细胞贴壁生长，需要营养液少。③悬浮培养：通过震荡，转动使细胞悬浮于液体中培养。④微载体培养：以固体小颗粒为载体，便于细胞附着，载体扩大了表面积。⑤中空纤维培养：细胞在中空纤维内生长。⑥微囊化培养：细胞在微囊中生长。3、细胞的制备细胞间有胶原蛋白，要破坏它们才变成分散单细胞。①机械分散：将组织剪碎成1mm3小块，再挤压通过铜丝网孔，可得到单细胞。②酶消化法：常用胰酶破坏细胞间质，活力1：250，浓度是0、25%，pH7、4-7、6。③鳌合剂分散法：EDTA可除去维护细胞间结合的Ga++和Mg++，常用于单层细胞的分散。4、细胞培养的要素①营养物资：培养液（含氨基酸，犊牛血清，维生素，盐，糖等成分）。现多用成品细胞培养基，engle液，RPMI-1640和DMEM等。②接种量：与单细胞生长成正比，量过大，因细胞碎片产生毒性作用，过小，不易长成单层。不同细胞有不同接种量，如鼠肾细胞50万/ml，鸡成纤维细胞20—40万ml，猪肾细胞80万/ml，血球计数室计数。③pH、温度、气体环境：pH7、2-7、4，不低于6、8，不高于7、6；温度一般是37℃，过高容易死亡，过低生长慢，20--25℃，细胞缓慢长。气体环境，一是橡皮塞密封培养；二是CO2培养箱培养。5、污染问题：①细菌、真菌、支原体污染，加一定量抗生素可杀菌，如加青链霉素100u，有霉菌污染加制霉菌素。②病毒污染：有组织代毒和培养带毒，前者用SPF动物组织可以解决，后者注意灭菌和消毒。③胶原虫：（存在犊牛血清），血清37℃培养1个月以上，高速离心，检查沉淀物。6、病毒增殖技术①选敏感动物细胞。②注意营养，温度和pH。③接种量和方法：1-10%接种，V/V；分同步和异步接种。④支原体污染，加抗生素。⑤细胞病变：CPE，有圆缩、聚合、合胞体、包涵体，轻微病变，以及无细胞病变。⑥收获：CPE到80%收获，反复冻融，离心取上清夜，测效价，加双抗，-20℃保存。第四节疫苗制造流程制造优良疫苗的关键：a、优良的菌种b、适宜的培养方法；c、良好生产工艺；d、严格的检验和标准。一、细菌灭活疫苗制造1、种子：毒力强，免疫原性好，1—3个菌株，菌种逐级扩大培养。2、培养：选适当培养基和方法，如固体或液体培养，要计数活菌和观察纯度。3、灭活和无菌检查：加适量甲醛37度灭活24h，接种斜面培养基无菌检查，4、浓缩提高含菌量：离心或沉淀方法。5、配佐剂分装