14基因工程菌的发酵-第十三章基因工程菌的发酵

第十三章基因工程菌的发酵近年来，重组DNA技术(基因工程)已开始由实验室走向工业生产，走向实用。它不仅为我们提供了一种极为有效的菌种改良技术和手段，也为攻克医学上的疑难杂症——癌、遗传病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能；为农业的第三次革命提供了基础；为深入探索生命的奥秘提供了有力的手段。现在由工程菌产生的珍稀药物，如胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等部已先后面市，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使成本大大下降。但是从许多研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌不稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术成就转化为生产力的关键之一。第一节工程菌的来源和应用一、何谓基因工程基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。基因工程的核心技术是DNA的重组技术。重组即利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。除DNA重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。基因工程一般分为4个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。DNA分子很小，其直径只有20埃，约相当于五百万分之一厘米，在它们身上进行“手术”是非常困难的，因此基因工程实际上是一种“超级显微工程”，对DNA的切割、缝合与转运，必须有特殊的工具。要把目的基因从供体DNA长链中准确地剪切下来，可不是一件容易的事。1968年，沃纳·阿尔伯博士、丹尼尔·内森斯博士和汉密尔·史密斯博士第一次从大肠杆菌中提取出了限制性内切酶，它能够在DNA上寻找特定的“切点”，认准后将DNA分子的双链交错地切断。人们把这种限制性内切酶称为“分子剪刀”。这种“分子剪刀”可以完整地切下个别基因。自70年代以来，人们已经分离提取了400多种“分子剪刀”。有了形形色色的“分子剪刀”，人们就可以随心所欲地进行DNA分子长链的切割了。DNA的分子链被切开后，还得缝接起来以完成基因的拼接。1976年，科学们在5个实验室里几乎同时发现并提取出一种酶，这种酶可以将两个DNA片段连接起来，修复好DNA链的断裂口。1974年以后，科学界正式肯定了这一发现，并把这种酶叫作DNA连接酶。从此，DNA连接酶就成了名符其实的“缝合”基因的“分子针线”。只要在用同一种“分子剪刀”剪切的两种DNA碎片中加上“分子针线”，就会把两种DNA片段重新连接起来。把“拼接”好的DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种分子小、能自由进出细胞，而且在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。理想的运载体是质粒，因为质粒能自由进出细菌细胞，应当用“分子剪刀”把它切开，再给它安装上一段外来的DNA片段后，它依然如故地能自我复制。有了限制性内切酶、连接酶及运载体，进行基因工程就可以如愿以偿了。运载体将目的基因运到受体细胞是基因工程的最后一步，目的基因的导入过程是肉眼看不到的。因此，要知道导入是否成功，事先应找到特定的标志。例如我们用一种经过改造的抗四环素质粒PSC100作载体，将一种基因移入自身无抗性的大肠杆菌时，如果基因移入后大肠杆菌不能被四环素杀死，就说明转入获得成功了。二、工程菌的获得1，确定目的产物。2，找出产该产物的细胞。3，将细胞破碎后提纯出全部信使RNA。这些信使中包含了该细胞内表达的所有蛋白质的合成信息。4，利用基因扩增技术（PCR），找出所需的目的基因。5，将目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了重组DNA分子。6，将重组后DNA分子引入到受体细胞内，然后选择合适的培养条件使细胞繁殖。根据选择性标记，从菌落中筛选出目的基因的重组(工程)菌。三、工程菌应具备的条件1，发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型菌株。2，菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。3，菌株不是致病株，也不产内毒素。4，代谢控制容易进行。5，能进行适当的DNA重组，并且稳定，重组的DNA不易脱落。四、工程菌的应用1，基因药物例如，红细胞生成素、胰岛素、干优素、乙肝疫苗、生长激素和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等。2，其它发酵产品例如酶制剂、氨基酸（苏氨酸、色氨酸）、抗生素等。第二节工程菌的培养就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的培养有着自身所特有的特点。一、安全问题关于基因工程的社会问题，必须提到它的潜在危险性。经过重组的菌和质粒一旦用于，工业化生产，就不可避免地进入自然界。这些菌能间接地危害人体健康，使治疗药物失去效用，污染环境等。因此，安全问题是极其重要的。1974年，提出了DNA重组实验具有潜在生物危险性的问题。后来，美、日等国都制定了有关DNA重组实验的准则，即在试管内用酶等构建异种DNA的重组分子，并用它转入活细胞中的实验，以及使用重组体的实验应遵循的规程。其目的是保证实验的安全和推动重组DNA的研究。这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验安全度的评定，采用物理密封(P1~P4)和生物学密封(B1和B2)两种方法。物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分B1和B2级，B2级的密封要求最严格。企业中进行重组菌培养时的设备标准有LS-1和LS-2。LS-2相当严格，工业生产起码应在LS-1的设备标准下培养。LS-1标准要点是：(1)使用防止重组菌体外漏，能在密闭状态下进行内部灭菌的培养装置；(2)培养装置的排气由除菌器排出；(3)使用易产气溶胶的设备时，要安装可收集气溶胶的安全箱等。设计用于基因重组菌的培养装置时，不仅要考虑外部杂菌的侵入，还要防止重组菌的外漏。此外，培养后的菌体分离、破碎等处理也必须在安全柜内进行，或是采用密闭型的设备。二、基因工程细胞培养特点前已述及，基因工程细胞培养过程与培养方式与天然细胞培养过程或方式基本—致。但亦有其自身持点。实践表明，基因工程细胞工业化培养中，产物的产率往往比实验室培养规模为低。其原因主要与基因工程细胞特点有关，首先基因工程细胞的生长速率及表达率与其所载外源DNA的稳定性及产物分泌过程有关，其中重组DNA的稳定性尤为重要，重组DNA在宿主内表达方式有两种，其一是游离表达方式、其二是结合表达方式。因此，基因工程细胞培养过程，重组DNA的丢失方式亦有两种，其一是细胞培养过程，由于回复突变或分配作用致使DNA丢失．称为脱落性不稳定，其二是重组DNA中编码的结构基因在宿主内发生再重组过程产生突变，不再表达目的产物，此称加结构性不稳定。其次为提高基因工程细胞表达效率，需采取适当措施，提高重组DNA在宿主细胞内的拷贝数及促进表达产物自细胞内向细胞外分泌。此外，基因工程细胞的原宿主通常是某些培养物质(如某种氨基酸或维生素等)的缺陷型，有些基因工程细胞生产过程亦产生某些抑制细胞生长的代谢物。由此，在培养工程中应考虑控制培养液营养成分及其浓度，同时采取措施，消除抑制细胞生长的代谢物，以保证细胞正常生长。由此可见，在基因工程细胞培养过程，除—般培养条件外，必需考虑基因工程细胞的自身特点，确定最佳培养条件。三、基因工程细胞的培养前已述及，基因工程细胞的培养过程与一般需氧细胞培养基本一致，同时培养方式亦无差异，可采用各种分批培养方式，亦可采用连续培养、半连续培养及透析培养等方式。至于影响基因工程细胞培养的细胞生物量得率与产物量的因素及有关参数。亦可参照普通细胞相应培养方式求得。目前关于动植物基因工程细胞培养工程的研究刚刚起步，有待进—步发展。这里仅对基因工程菌的营养控制、质粒稳定性、重组质粒拷贝数的控制及表达效率作简单讨论。1，底物浓度的控制在基因工程茵培养过程，至少要遵循PI级物理防护的规定，因此必需进行菌体的高密度培养。普通E．coli培养时最高干重菌体收率可达12．5％，酿酒酵母可得14.5%，浙枯草杆菌仅可得2%左右。根据这些结果采用枯草杆菌不太合适，除非其具有产物的高效分泌系统。从生物安全性考虑，培养的基因工程菌通常是维生素或氨基酸的营养缺陷型突变株。培养过程细胞对维生素需求量甚微，在培养开始即加入必需量对细胞生长并无影响，但培养一开始即加入足够量氨基酸则可能因氨基酸浓度过大而抑制细胞生长。在此情况下，可采取培养过程中，在调节pH值同时补加氨基酸混合物和葡萄糖的方法，以便培养过程葡萄糖及氨基酸浓度的基本恒定，从而实现高密度培养，如E．coliC600株培养时可获得6％干菌体。但菌体对葡萄糖及氨基酸的收率因培养条件而异，如以葡萄糖及分别用苏氨酸、亮氨酸、组氨酸及色氨酸为底物时，则平均每克底物所获干菌体量分别为0.3、2.5、15、40及40g。按每克干菌体成本计，应用苏氨酸成本最高，故应避免应用苏氨酸缺陷型菌株为宿主，最好选用维生素缺陷型菌株为宿主。2、质粒稳定性重组质粒上通常载有Apr基因，获得该类重组质粒的基因工程菌在含氨苄青霉素培养液中可以生长，而非基因工程菌不能生长。但在基因工程菌高密度培养时，外加的抗生素AP易于失活，影响培养。为此考虑采用抗生素依赖性变异法替代抗生素添加法。其方法是通过诱变使宿主成为某抗生素依赖性突变株(如链霉素依赖性Smd)。只有在Sm存在下宿主才能生长，但重组质粒上含有Sm非依赖性(Smid)基因，将重组质粒导入宿主细胞后，所获克隆菌可在不含抗生素培养基中生长，而丢失质粒菌株却不能生长。此法很有实用价值，但缺点是宿主细胞易产生回复突变，造成培养工程复杂化，产物产率下降。为考察质粒稳定性，在此引入质粒保持率Fn的概念，Fn表示分批培养中细胞分裂n次后，培养液中基因工程细胞数与总细胞数的比值，即假定在分批培养过程中，细胞在对数生长期每次分裂时，其质粒丢失率为P，则Fn为：式中α-质粒丢失菌株与质粒保持率菌株μ的比值；n-细胞分裂次数理论上基因工程菌载荷外源性基因，培养过程细胞大量合成外源性产物，其负荷大于质粒丢失菌株，故基因工程菌株比生长速率μ通常较质拉丢失菌株小，当然亦有变化不大者。根据以上方程计算结果，Fn变化情况如图7-20所示。由图7-20可知．假定P＝1%，当α＝0时，表明质粒丢失菌株不能生长，培养处于最理想的稳定状态，亦为质粒最稳定状态，此时Fn接近于1.0；但在无选择压力下，α值越大，Fn越低，即质粒稳定性越差。在基因工程细胞的连续培养方式中，若无选择压力，迪常不能得到恒定的稳定状态。而在有选择压力下，则可获得稳定状态。但是培养基也与质粒稳定性有关，采用天然培养基培产时质粒稳定件较用合成培养基为高，在天然培养基中即使无选择压力亦可保持质粒的稳定性，因此，用天然培养基进行连续培养是获得质粒稳定性的良好方法。3，表达效率及质粒拷贝数控制在基因工程细胞培养工程中，表达效率与质粒拷贝数有关。在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内质粒拷贝数。在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长速率升高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量提高。如图7-21所示，在25℃下，培养含有穿梭质粒