石蜡切片组织RNA提取

ANNUALBUSINESSREVIEW从石蜡切片组织中提取RNA董进曲/JinquDong2013.12.26-2-概览有关石蜡组织切片样品处理试剂及仪器RNA质控RNA提取RNA质控补：DNA石蜡组织切片。电泳定量-3-有关石蜡切片石蜡切片（paraffinsection）：组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的。活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构。-4-有关石蜡切片石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤。一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。-5-Ambion1975-6-石蜡组织切片RNA提取：实验原理二甲苯&Ambion1975试剂盒：蛋白酶K：消化与RNA结合的组蛋白关键点：二甲苯：溶解并去除石蜡通过二甲苯的去蜡以及蛋白酶K使RNA从石蜡组织中裂解释放，并通过DNA吸附柱有效提取RNA.后续分析困难受破坏RNA（固定步骤）降低RNA得率注：RNA降解-7-内容1、样品处理2、RNA抽提有关石蜡组织切片样品处理试剂及仪器RNA质控RNA提取RNA质控补：DNA石蜡组织切片。电泳定量-8-样品处理存放位置,使用情况,是否返还样品移交记录（实验室间）实验室信息管理系统MicrosoftExcel手写记录组织蜡块切片提取及质检RNA实验/数据-9-RNA提取前组织蜡块切片提取及质检RNA实验/数据1.1实验前的准备工作1.1.1打开超净台的紫外灯，灭菌15min，然后通风10min。1.1.2在第一次使用Wash1和Wash2/3之前，按照下列步骤加入无水乙醇：加入42mL的无水乙醇（如试剂瓶上所示）至Wash1中，充分混匀，即为工作液；加入48mL的无水乙醇（如试剂瓶上所示）至Wash2/3中，充分混匀，即为工作液。1.1.3用镊子将刀片蘸取少量酒精，酒精灯上灼烧刀片，冷却后备用。-10-1.石蜡组织切片收集及鉴定2.组织切片刮取3.去除石蜡4.裂解消化DNA5.消化DNA与收集RNA每个样本以约300ul的石蜡组织切片量为宜.使用一次性解剖刀从组织片中刮取石蜡组织至离心管中，尽量防止组织碎片飞散造成交叉污染.通过蛋白酶消化组蛋白,消化裂解3h。（加入4µL蛋白酶，）使用Ambion1975纯化柱收集石蜡组织切片RNA提取步骤向含有石蜡组织的离心管中加入二甲苯，通过二甲苯溶解石蜡并去除，再用无水乙醇去除二甲苯。-11-RNA提取前1.2操作步骤1.2.1石蜡包埋组织样品的预处理1.2.1.1.取石蜡块和一张干净的称量纸，使用冷却后的洁净刀片将组织轻轻刮下来，刮片厚度不大于50µm，尽量避免刮下石蜡。注意：切取石蜡组织块的时候，组织碎屑越薄越好，并且尽可能少地切取石蜡块。1.2.1.2.将刮取的组织小心地转移至干净的1.5ml离心管中，至总体积约为300µL。1.2.1.3.如果样品为石蜡切片，可以直接进行后续的脱蜡处理，但是建议5-20µm石蜡卷量不要超过总厚度80µm：即5µm切片取16片，而20µm切片取4片。注意：如果需要进行miRNA实验，石蜡切片厚度应不低于10µm。-12-3.RNA抽提1.2.2二甲苯脱石蜡1.2.2.1.加入1ml二甲苯，至上述离心管中，盖紧盖子，剧烈震荡混匀5min；瞬时离心，将附着在管壁的组织收集至管底；50℃，3min，离心机最大转速室温离心2min，弃上清。注意：二甲苯有毒，应尽量在通风橱中开盖操作，以减少实验室空气污染。1.2.2.2.观察形成的组织沉淀是否很紧实，如果异常，重复1.2.2.1实验操作。1.2.2.3.加入1ml无水乙醇至离心管中，剧烈震荡混匀2min，离心机最大转速（13200rpm)室温离心2min，小心弃上清；重复此步骤一次。-13-3.RNA抽提1.2.2.4.弃上清，室温短暂离心，用移液器将剩余的无水乙醇吸出。1.2.2.5.真空旋转浓缩仪干燥组织中残余乙醇（5min)，45℃，浓缩时间＜20min；如果室温晾干组织沉淀，时间为15-45min。。1.2.3蛋白酶消化-14-3.RNA抽提1.2.3.2加入4μLProtease后，上下颠倒混匀，如果组织附着在管壁上，用枪头或瞬时离心使组织浸入到裂解液里。1.2.3.3置于恒温金属浴中孵育，50℃，500rpm摇动3h；然后70℃，500rpm摇动20min。注意：如果延长70℃反应时间，有可能导致RNA降解，故不要随意延长时间。-15-3.RNA抽提1.2.4总核酸提取1.2.4.2混匀，吸取700µL混合液至过滤柱里，为放止堵住过滤柱，避免吸到大块未被消化掉的组织块到过滤柱里，然后10,000g，30s，弃滤液至原管。1.2.4.3加700µLWash1至FilterCartridge上，10,000g，30s，弃滤液。-16-3.RNA抽提1.2.4.4加500µLWash2/3至FilterCartridge上，10,000g，30s，弃滤液。1.2.4.5空甩，10,000g，30s，，去除残留洗液。1.2.5DNA酶消化和RNA分离纯化-17-3.RNA抽提1.2.5.2加入60µLDNasemix至每个FilterCartridge中心，盖上管盖，室温孵育30min。1.2.5.3加700µLWash1至FilterCartridge上，室温孵育30-60s后，10,000g，30s，弃滤液。1.2.5.4加500µLWash2/3至FilterCartridge上，10,000g，30s，弃滤液；1.2.5.5重复一次4.2.5.4操作后，10,000g，空甩1min。1.2.5.6将FilterCartridge转入另一新CollectionTube管中，加60µLElutionSolution到滤膜中心，盖上管盖室温静置1min后，最大转速1min。1.2.5.7进行NanoDropRNA定量，如果不马上定量，将样品保存于-80℃。-18-使用二甲苯脱蜡，去蜡更完全，但二甲苯有毒；注意事项观察脱蜡后形成的组织沉淀是否很紧实，如果异常，重复脱蜡;真空旋转浓缩仪干燥组织中残余乙醇,充分干燥影响下一步消化;电泳：用DEPC水清洗，及配胶（加甲醛）;-19-控制交叉污染必须严格控制样品间交叉污染一个样品用一个解剖刀片实验前后清洁工作区经常换手套无PCR产物区域尽量防止组织碎片飞散造成交叉污染-20-试剂、仪器及耗材-21-试剂、仪器及耗材-22-试剂、仪器及耗材-23-Thanks！