流式细胞仪的参数

章晓联教授武汉大学医学院免疫学系流式细胞仪FLOWCYTOMETER原理及应用流式细胞术流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆抗体技术、激光技术、电子计算机技术等学科高度发展、综合的结晶。流式细胞仪的应用标志着细胞学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平的研究.一、流式细胞术的原理流式细胞术(FCM,FlowCytometry):是对单个细胞或其他生物微粒进行快速定性,定量分析与分选的一门技术。FCM是利用流式细胞仪(FlowCytometer)分析在高压高速下通过样品孔径的单个细胞,在激光束的照射下的发出的散射光和与细胞表面结合的荧光标记的单抗的荧光信号。流式细胞仪与显微镜FLOWMICROSCOPE光源激光自然光、灯光、氙(汞)灯对象细胞、生物粒子细胞、生物粒子承载工具载(盖)玻片鞘液及流动室检测信号光学信号形态及染色放大方式PMT，放大电路目镜X物镜,光学放大统计人工，200计算机，5000结果简单，单参数多参数，综合分析二样品的制备和数据的收集流式细胞仪分析的细胞需要是单细胞悬浮液,凝集或块状的细胞不适宜流式细胞仪的使用。全血或Ficoll-Hypaque分离的单核细胞,用标记的单抗染色,裂解红细胞然后在流式细胞仪上,通过包被细胞的液流的鞘液进行分析。流路单细胞悬液大多数仪器是在50-300µm大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中这一过程,成为流体动力学聚焦FLOWCELLInjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluidexcitedelectronENERGYEMITSENERGYASLIGHTATOM每种荧光染料均有特定的激发波长,并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长。利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号。光路-荧光信号常用荧光染料FITC=fluoresceinisothiocyanate(异硫氰酸呱荧光素)PE=phycoerythrin(RD1)(藻红蛋白)ECD=energycoupleddye(藻红蛋白-德州红)PI=propidiumiodide(碘化丙啶)PC5=phycoerythrincyanin5(PeCy5)(藻红蛋白-花青苷5)ultra-violetbluegreenyelloworangeredinfra-violetredFITC520PE575ECD615PC5665LASER488PI620400-450l450-500l500-570l570-590l390l590-620l620-750l750l4ColorSingleLaser(488nm)FITC/PE/ECD/PC5常用荧光染料的特性荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE(RD1)488575免疫荧光橙色ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红PI488620DNA染色橙红PECy7488755免疫荧光深红PerCP488670APC633670检测信号散射光信号FS:前向角散射光SS:侧向角散射光(90度散射光)荧光信号荧光染料光学滤片荧光信号的分析:是利用荧光染料或荧光素标记的单抗(如异硫氰基荧光素fluoresceinisothiocyanate,FITC,绿色荧光;藻红蛋白PE(phycoreythrin),红色荧光),检测结合单抗的单个细胞发射的荧光信号。流式细胞仪的参数:(1)散射光FSC:细胞的大小和尺寸;(2)散射光SSC:细胞内颗粒物质的大小和多少;(3)荧光参数:荧光染料或荧光抗体散射光:与细胞的大小和细胞的内容物及其复杂性相关.☆大细胞产生更多的FSC(forwardlightscatter,前向角散射);☆细胞的内容物更复杂的(如含颗粒,线粒体等)产生更多的SSC(SSC，SideScatter,侧向角散射)。NeutrophilsMonocytesLymphocytesLightScatterGating流式细胞仪的测定数据表示:(1)单参数直方图:以细胞数为纵坐标,以FSC,SSC,FL1,FL2等为横坐标;(2)双参数二维点图:以FSC,SSC,FL1,FL2等中两个参数为X,Y轴,在二维点图每个点代表一个细胞;(3)三参数三维图:任选一个参数为X,Y轴,再以细胞数或参数为Z轴。SingleParameterHistogramDNA含量直方图和抗原表达直方图单参数直方图DualParameterHistogramsLogFITCFluorescence(CD8).11101001000LogPEFluorescence(CD4).1110100123445%2%26%27%双参数二维点图3-DHistograms三参数三维图四流式细胞仪在医学和生物学中的应用细胞生物学临床免疫学临床血液学临床肿瘤学细胞凋亡血栓与止血骨髓和器官移植基础医学研究1.FCM在细胞生物学中的应用:(1)细胞周期分析:DNA和RNA特异性染料有PI,EBMI,CA3,HO.33258,HO.33342,DAPI,7-AAD,AO和PY等.通过抗溴脱氧脲嘧啶核苷(BrdUrd)的单克隆抗体也可对DNA进行染色。(2)细胞内钙离子浓度测定:荧光染料(如Quin-2,Indo-1,Fura-2,Fluo-3和Rhod-2等)通过乙酰甲脂(AE)导入细胞后,与钙离子特异性结合.故测荧光强度可得到钙离子浓度的相对值。(3)细胞内pH值测定:荧光染料(BCECF,COFDA,DCH等)激发光谱或发射光谱是pH值依赖的.在生理pH值范围内,比例荧光与pH值有很好的线性关系。2.FCM在免疫学中的应用:(1)各种免疫细胞的表面标志,细胞分选等;(2)细胞内各种细胞因子的检测;(3)HLA群体分型;(4)细胞增殖CFSE法：活体染料羧基荧光素酰乙酸（Carboxyfluoresceindiacetate，succinimidylester，CFDA-SE）是一种非极性分子，可自由穿透细胞膜并在细胞内被酯酶转化成具有绿色荧光的氨基反应性羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）。CFSE只有当细胞发生分裂时，才会平均地分配到子代细胞中。因此CFSE含量减少的细胞代表增殖的子代细胞。免疫细胞的表面标志，淋巴细胞亚群分析举例说明:正常人外周血细胞的分析:在R1lymphocytes区,分析T/B细胞的表面标记:70%是CD3+T;30%是CD3-,CD19+B细胞在T细胞中,分析CD4+T,CD8+T在B细胞中,k和l各占50%在R2monocytes区,均是CD14+,CD45+在R3granulocytes区,均是CD13/33+,CD45+3.细胞凋亡的FCM检测●Apo2·7：利用早期细胞凋亡时线粒体功能紊乱的特征性标记物Apo2.7检测●TUNEL：分子生物学与形态学相结合的晚期凋亡检测法●AnnexinⅤ：利用细胞早期凋亡时细胞膜表面结构及成份的变化进行检测●Caspase(半胱氨酸蛋白酶)：以细胞凋亡信号通路中的蛋白作为标志物来检测FCM分析细胞凋亡:AnnexinⅤ磷脂结合蛋白作为探针识别细胞膜表面磷脂酰丝氨酸细胞凋亡早期，细胞表面发生变化，细胞膜内部的磷脂酰丝氨酸（PS）可以迁移到细胞外层表面。巨噬细胞就是通过识别凋亡细胞表面的PS将凋亡细胞或凋亡小体吞噬，保护机体避免因细胞内部暴露引起的炎症反应。AnnexinⅤ是一种Ca离子依赖的，对PS有高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别细胞膜是否有PS，识别凋亡细胞，由于坏死细胞也可能在膜表面出现PS，故需要同时进行染料（PI）排斥实验，凋亡细胞膜完整，不能染色。SchematicrepresentationoftheAnnexinVassayFCM分析细胞周期和凋亡:根据细胞DNA含量的改变凋亡细胞DNA的降解,凋亡的细胞因核酸内切酶的活性增强，使DNA分裂成一些小片段，这些小片段因细胞膜的通透性的增加而漏出胞外，使凋亡细胞的DNA含量相对减少，与荧光染料的结合减少,故细胞DNA荧光强度降低;DNA直方图上显示在G0/G1峰前出现一个DNA含量减少的亚二倍体或称亚G0/G1峰,又称凋亡峰.通过DNA含量可同时研究凋亡细胞的周期特异性。利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等)与细胞内DNA碱基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光，荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的DNA含量.细胞DNA分析原理细胞周期与DNA的倍体关系细胞周期：DNA倍体G0期：DNA合成静止期2NG1期：DNA合成前期2NS期：DNA合成期2N-4NG2期：DNA合成后期4NM期：细胞分裂期4NG2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle4.临床疾病的诊断及治疗依据(2)机体免疫功能监测的应用例子：●自身免疫性疾病HLA-B27:强直性脊柱炎相关标志●变态反应性疾病CD23:与变态反应严重程度呈正相关(1)FCM在血液,肿瘤学中的应用;如白血病,淋巴细胞瘤的诊断和分类,肿瘤的监控;在药理学中的应用.(3)器官移植后免疫监测提示排异-------CD3+/CD25+基线5-10%以上提示肾穿-------CD3+/CD25+持续增加预测感染-------CD4/CD8比值下降指导免疫抑制剂应用--CD4/CD80.2必须停药提示MCV感染------CD3+/HLA-DR+增加5-10%不伴CD25增加(4)AIDS诊断及治疗监控标本的制备免疫标记（膜表面)的样本处理保证单细胞悬液：组织标本采用机械法、酶法。300目尼龙网过滤调整细胞浓度：2~5X106/ml，标记：取100ul样本+适量抗体孵育：室温避光20分（或根据抗体说明）（加二抗）溶血：溶血剂的选择（市售、氯化氨、草酸氨）检测：标本的制备免疫标记（细胞浆内)的样本处理先将细胞膜“打孔”----破膜破膜剂的选择：Triton皂素毛地黄毒甙按前述方法进行标记标本的制备细胞周期分析的样本处理传统方法：单细胞悬液（如全血，则需分离单个核细胞）冰乙醇固定过夜洗涤细胞加复合染液（Triton，RNA酶、PI）20--30分钟后上机检测BC公司DNA-Prep试剂溶血（如需要）固定染色一步完成20分钟后上机检测FCM对照设置1.阳性对照：使用已知阳性样本，帮助排除试剂的质量、浓度、特异性以及染色方法等因素造成的假阴性结果。2.阴性对照（1）空白对照：由于存在自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光，需要设立空白对照来去除自发荧光信号（噪声信号）。（2）同型阴性对照：就是将空白对照样品用同型对照抗体标记，用于排除非特异性染色和自发荧光。是指与单克隆抗体相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光标记法染色，同型对照也应标记荧光素。（3）补偿对照（双色或多色分析时）荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectraloverlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。需要将单种荧光素标记的单克隆抗体分别进行单色荧光染色，几色分析就需要制备几个补偿对照管选择荧光抗体常用的多色组合：FITC＋PE：最常用的双色组合;FITC＋PE＋PE-Cy5：最常用的三色组合，进行多色荧光染色时荧光光谱重叠补偿很小;FITC＋PE＋PerCP+APC：最常用的四色组合.一般PE和APC用于检测表达较低的抗原上，而FITC和PerCP用于检测表达较高的抗原上。思考题1.试述流式细胞仪的原理,主要检测信号和参数;2.举例说明流式细胞仪的应用。