酶促反应动力学资料

酶促反应动力学化学反应的两个基本问题：•反应进行的方向、可能性和限度•反应进行的速率和反应机制一、化学动力学基础化学热力学化学动力学（一）反应速率及其测定——以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来表示。（二）反应分子数和反应级数1.反应分子数：——反应中真正相互作用的分子的数目单分子反应：AP双分子反应：A+BP+Q•单分子反应v=kc•双分子反应v=kc1c2c、c1、c2：反应物浓度（mol/l）k：比例常数/反应速率常数2.反应级数能以v=kc表示，为一级反应；能以v=kc1c2表示，则为二级反应；v与反应物浓度无关，则为零级反应。双分子反应、一级反应（三）各级反应的特征1.一级反应：反应速率与反应物浓度的一次方成正比。v=kcC0C0/20t½[P]Ct反应物的消耗产物的增加半衰期t1/2：有一半反应物转化为产物所需的时间lnC0lnC0/20t½Ctk当t=t½时，c=1/2c0,则t½＝0.693／k,即半衰期与反应物的初浓度无关。2.二级反应：v=k（a-x）（b–x）a、b：反应物A、B的初浓度x：t时已发生反应的物质浓度（a-x）、（b–x）：t时后A、B的浓度3.零级反应：v=k一级反应：半衰期与反应物的初浓度无关二级反应：半衰期与反应物的初浓度成反比零级反应：半衰期与反应物的初浓度成正比单底物、单产物反应；酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示；反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度；底物浓度远远大于酶浓度。（[S]》[E]）研究前提二、底物浓度对酶反应速率的影响产物0时间初速度酶促反应速度逐渐降低酶促反应的时间进展曲线在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。V0底物浓度[S]反应初速度反应初速度随底物浓度变化曲线当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。[S]VVmax随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。[S]VVmax当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应[S]VVmaxE+SESP+Ek1k2k3（一）中间络合物学说k4三个假设：（1）E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即V＝k3[ES]。（2）S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。（3）P→0忽略这步反应ESE+Pk4E+SESE+P（二）酶促反应的动力学方程式1、米氏方程的推导1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程(Michaelisequation)。[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximumvelocity)Ｋm：米氏常数(Michaelisconstant)ＶVmax[S]Km+[S]＝──稳态时ES浓度不变反应速度V=k3[ES]ES的生成速度=消耗速度k1[E][S]=k2[ES]+k3[ES]E的质量平衡方程[E]=[Et]-[ES]E+SESP+Ek1k2k3(Ⅲ)(Ⅰ)(Ⅱ)稳态时ES浓度不变反应速度V=k3[ES]ES的生成速度=消耗速度k1[E][S]=k2[ES]+k3[ES]E的质量平衡方程[E]=[Et]-[ES]E+SESP+Ek1k2k3V=V[S]Km+[S]米氏方程V=Vmax=k3[ES]max=k3[Et]Km=k2+k3k1米氏常数a.当[S]很小时V=V[S]/Km一级反应V0底物浓度[S]反应初速度反应初速度随底物浓度变化曲线VVV/20Km（米氏常数）[S]最大反应速率米氏曲线V=V[S]Km+[S]b.当[S]很大时V=V[S]/[S]=V0级反应混合级Km=?•Km=[S]V=V[S]Km+[S]若V＝V/2V2＝V[S]Km+[S]1Km+[S]=2[S]2、动力学参数的意义（1）米氏常数Km的意义Km＝[S]∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。2＝Km+[S]VmaxVmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2①Km是酶的特性常数：与pH、温度、离子强度、酶及底物种类有关，与酶浓度无关，可以鉴定酶。酶底物Km(mmol/L)脲酶尿素25溶菌酶6-N-乙酰葡萄糖胺0.006葡萄糖-6-磷酸脱氢酶6-磷酸-葡萄糖0.058胰凝乳蛋白酶苯甲酰酪氨酰胺2.5甲酰酪氨酰胺12.0乙酰酪氨酰胺32.0②可以判断酶的专一性和天然底物Km值最小的底物——最适底物/天然底物1/Km近似表示酶对底物的亲和力：1/Km越大、亲和力越大Km=k2+k3k1Km≈k2（分离能力）/k1（亲合能力）E+SESP+Ek1k2k3Km越小，亲和力越强。[S]很小时，反应速度就能达到很大。性能优，代谢中这类酶更为重要k2k3时④Km可帮助判断某代谢反应的方向和途径催化可逆反应的酶对正/逆两向底物Km不同——Km较小者为主要底物③根据Km：判断某[s]时v与Vmax的关系判断抑制剂的类型乳酸脱氢酶（1.7×10-5）丙酮酸脱氢酶（1.3×10-3）丙酮酸脱羧酶（1.0×10-3）丙酮酸乳酸乙酰CoA乙醛丙酮酸浓度较低时：代谢哪条途径决定于Km最小的酶一底物多酶反应（2）Vmax和k3（kcat)的意义一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一个常数。[S]很大时，Vmax＝k3[E]。k3表示当酶被底物饱和时，每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，——又称为转换数、催化常数kcatkcat越大，酶的催化效率越高（3）kcat/km的意义：V=Vmax[S]Km+[S]∵Vmax=kcat[Et]∴V=kcat[Et][S]Km+[S]当[S]Km时，[E]＝[Et]是E和S反应形成产物的表观二级速率常数。其大小可用于比较酶的催化效率。kcat/km＝k3k1k2+k3kcat/km的上限为k1,即生成ES的速率，即酶的催化效率不超过E和S形成ES的结合速率kcat/km的大小可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。（1）Lineweaver-Burk双倒数作图法3、Km与V的求取蔗糖酶米氏常数（Km）的测定1.配12支蔗糖底物溶液，浓度分别为0、0.005、0.00625、0.0075、0.00875、0.010、0.0125、0.015、0.02、0.025、0.0375、0.050M，在35℃水浴保温；2.加入3U/ml已在35℃水浴保温的酶溶液，准确作用5分钟，终止反应；3.各吸取0.5ml反应液与3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5分钟，冷却后在540nm测定吸光度OD值；4.作图（2）Eadie-Hofstee作图法v=Vmax-Kmv[S]vV[S]Vmax斜率－Km（3）Hanes-Woolf作图法[S]v=[S]Vmax+KmVmax斜率=1/VmKm/Vm-Km[S]/V[S]Vmax=v+v[S]KmvVmax[S]－3Km－2Km－Km（4）Eisenthal和Cornish-Bowden线性作图法（三）多底物的酶促反应动力学分为单底物、双底物和三底物反应1.酶促反应按底物分子数分类：①有序反应（orderedreactions）领先底物释放释放A和Q竞争地与自由酶结合（1）序列反应或单－置换反应2.多底物反应按动力学机制分类：②随机反应（randomreactions）如肌酸激酶使肌酸磷酸化的反应AAEPE’PEE’QEQEBBA和Q竞争自由酶E形式B和P竞争修饰酶形式E’A和Q不同E’结合B和P也不与E结合。(2)乒乓反应或双－置换反应3.双底物反应的动力学方程（1）序列机制的底物动力学方程及动力学图——在B的浓度达到饱和时A的米氏常数——在A的浓度达到饱和时B的米氏常数——底物A与酶结合的解离常数——底物A、B都达到饱和时最大反应速率（2）乒乓机制的底物动力学方程及动力学图——在B的浓度达到饱和时A的米氏常数——在A的浓度达到饱和时B的米氏常数——底物A、B都达到饱和时最大反应速率三、酶的抑制作用失活作用：使酶Pr变性而引起酶活力丧失。抑制作用：使酶活力下降但不引起变性。抑制剂：能引起抑制作用的物质。（一）抑制程度的表示方法V0：Vi：不加入抑制剂时的反应速率加入抑制剂后的反应速率以反应速率的变化表示1.相对活力分数（残余活力分数）a=viv0a%=viv0×100％2.相对活力百分数（残余活力百分数）V0ViViV03.抑制分数——指被抑制而失去活力的分数i=1－a=1－viv0V0Vi4.抑制百分数i％=(1－a)×100％=（1－viv0）×100％ViV0抑制率依据：能否用透析、超滤等物理方法除去抑制剂，使酶复活。不可逆抑制与可逆抑制（二）抑制作用的分类1、不可逆抑制作用：抑制剂与酶必需基团以牢固的共价键相连很多为剧毒物质重金属、有机磷、有机汞、有机砷、氰化物、青霉素、毒鼠强等。不可逆抑制不可逆抑制剂非专一性不可逆抑制剂（作用于一/几类基团）专一性不可逆抑制剂（作用于某一种酶的活性部位基团）2、不可逆抑制剂不可逆抑制（1）非专一性不可逆抑制剂①重金属离子Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+、Fe3+高浓度时可使酶蛋白变性失活；低浓度时对酶活性产生抑制。——通过加入EDTA解除H2N-CH-COOHCH2SHH2N-CH-COOHCH2S-CH2COOHICH2COOHHI②烷化剂（多为卤素化合物）++碘乙酸③有机磷化合物（敌百虫、沙林）胆碱酯酶OHPOC2H5OC2H5S有机磷农药部分+(CH3)3N+CH2CH2OCOCH3(CH3)3N+CH2CH2OH+CH3COOHH2O胆碱乙酰化酶胆碱酯酶胆碱乙酰胆碱积累导致神经中毒症状如何紧急救治？排毒•洗胃、喝鸡蛋清牛奶•导泄、利尿•血液透析（清除游离状态毒物）•解毒药：解磷定NCH3CHNOHROOROOROXROO—EP+E—OHP+HX有机磷化合物羟基酶磷酰化酶(失活)酸ROOROO—EP+-CHNOH磷酰化酶(失活)N+CH3-CHNN+CH3OOROOR+E—OHP解磷定解毒------解磷定(PAM)：④有机汞、有机砷化合物——与酶分子中-SH作用；可通过加入过量巯基化合物解除。⑤氰化物、硫化物和CO——与酶中金属离子形成稳定的络合物如氰化物与含铁卟啉细胞色素氧化酶结合⑥青霉素（penicillin）与细菌糖肽转肽酶Ser-OH活性，影响细胞壁合成。（2）专一性不可逆抑制剂①Ks型•具有底物类似的结构——（设计）•带有一活泼基团：与必需基团反应（抑制）∵利用对酶亲合性进行修饰∴亲合标记试剂（affinitylabelingreagent）②Kcat型•具有底物类似的结构•本身是酶的底物•还有一潜伏的反应基团“自杀性底物”抑制作用可通过透析等方法除去。•原因：非共价键结合可逆抑制竞争性抑制(competitiveinhibition)非竞争性抑制(non-competitiveI.）反竞争性抑制(uncompetitiveI.)3、可逆抑制作用：（1）竞争性（Competitive)抑制I：抑制剂（inhibitor）【举例】丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶COOHCH2CH2COOHCOOHCOOHCH2丙二酸琥珀酸琥珀酸脱氢酶FADFADH2延胡索酸琥珀酸竞争性抑制磺胺类药物的抑菌机制：与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶二氢蝶呤啶＋对氨基苯甲酸＋谷氨酸二氢叶酸合成酶二氢叶酸COOHH2NSO2NHRH2N磺胺类药物利用竞争性抑制是药物设计主要思路磺胺类药抗菌机理：（与对氨基苯甲酸是结构类似物）竞争性抑制细菌叶酸形成，抑制细菌繁殖人通过食物直接补充叶酸，对人无毒害。生物碱麻醉—竞争性替代•生物碱—吗啡、海洛因、可卡因、尼古丁吗啡海洛因麻醉机理源自—37C医学网痛觉神经信号阿片—鸦片类物质生物碱竞争性替代脑肽—麻醉致幻脑肽(E)控制痛觉信号的释放抑制物（2）非