细菌性疫苗讲义

细菌性疫苗2008.3細菌性疫苗种类1.死疫苗2.活疫苗3.蛋白类疫苗4.多糖类疫苗5.多糖蛋白结合疫苗细菌性疫苗种类23白喉破伤风百日咳乙型肝炎疫苗……451霍乱伤寒副伤寒百日咳疫苗……卡介苗鼠疫布氏杆菌伤寒痢疾霍乱疫苗……脑膜炎伤寒vi肺炎疫流感嗜血杆菌多糖疫苗……AC脑膜炎球菌多糖结合疫苗HIB……脑膜炎伤寒vi肺炎疫流感嗜血杆菌多糖疫苗……白喉疫苗伤寒疫苗结合疫苗白喉疫苗一、概述二、病原学三、白喉杆菌的致病力及毒素产生的遗传学四、白喉毒素五、白喉类毒素六、生产工艺七、类毒素的质量检定概述外毒素对神经系统损害细菌产生的外毒素对心肌损害外毒素对肾脏损害白喉曾经是对儿童威胁非常大的传染病。它是由白喉棒状杆菌引起的一种呼吸道传染病主要临床表现为上呼吸道发炎，常常表现在咽部，有时在鼻腔、喉部和气管，白喉流行三个特点•传染原：白喉杆菌是严格寄生于人类的细菌没有中间宿主，病人及带菌者是一的传染原。•传播途径：主要是呼吸道飞沫传播，也可通过被污的器具和食物传播。•易感人群：人对白喉普遍易感，新生儿1岁时白喉易感性达高峰。二、病原学•白喉棒状杆菌菌体一端或两端膨大呈棒状，有着色较深的异染颗粒，革兰氏染色阳性，白喉杆菌无动力，无荚膜，不行成芽孢。•白喉杆菌是需氧菌，最适温度为34～35℃。能分解葡萄糖、麦芽糖和糊精，产酸不产气，能还原硝酸盐，不产生吲哚，不消化蛋白。•白喉杆菌对抗生素有不同程度敏感，对青霉素和红霉素极敏感；对消毒剂抵抗力弱，1％石碳酸1min或3％苯酚10min可将该菌杀死。不耐热，58℃10min或100℃1min即可被杀死。三、白喉杆菌的致病力及毒素产生遗传学•自然界中动物不感染白喉，只能在敏感动物中造成人工感染。猴、马、家兔和豚鼠对白喉敏感，小白鼠对白喉不敏感，实验室常用的动物是家兔和豚鼠。•白喉是由白喉杆菌产生毒性很强的外毒素引起的，白喉杆菌的产毒基因是由β嗜菌体携带，β嗜菌体感染无毒白喉杆菌后，嗜菌体DNA与细菌DNA整合，形成溶原性白喉杆菌而获得产毒能力（PW8株目前用于白喉类毒素生产)。四、白喉毒素•白喉毒素对人和动物都引起致死性毒性，如心脏、肾上腺、肝、肾、胰及神经组织等均受到损害。•白喉毒素是单一多肽，由560个氨基酸组成，分子量为62kDa,等电点pH4.1，在pH6时加热55℃很快失活。•通过物理和化学方法将其纯化。五、白喉类毒素细菌毒素甲醛类毒素类毒素经是甲醛处理后去除毒性而保留免疫原性影响脱毒因素甲醛浓度温度PH脱毒温度、pH和甲醛浓度等均影响脱毒效果•温度越高脱毒越快，超过40℃影响抗原性，一般37～38℃。•在酸性时脱毒较慢，但游离甲醛含量高，可导致脱毒过甚；在碱性时脱毒快，但抗原性损失较大，一般采用弱碱性。•甲醛浓度大则脱毒快，但抗原损失大。类毒素的毒性逆转1.温度升高加快毒性逆转，游离甲醛的浓度越低越易发生毒性逆转，毒素纯度高易发生毒性逆转。2.提高脱毒pH，提高甲醛浓度，提高脱毒温度和延长脱毒时间均可减轻毒性逆转；精制类毒素中非蛋白氮含量高者逆转程度小，于精制毒素中加入赖氨酸、精氨酸等可明显防止或减轻毒性逆转。六、白喉疫苗工艺流程示意图菌种（PW8株）传代扩增3～4代发酵罐培养34～35℃培养40～48h对数生长末期收获，甲苯杀菌。离心去菌体收集清液超滤浓缩3万分子量超滤浓缩硫酸铵盐析两段盐析除盐除菌氨离子及无菌检查脱毒0.5％甲醛液37℃40～50天脱毒试验（家兔）原液检定（浓度、纯度、安全等）Al(OH)3吸附成品检定（安全、效价等）七、类毒素的质量检定•絮状单位（Lf）是毒素或类毒素与抗毒素的结合单位，只能代表“量”而不能完全代表活性。使用抗毒素絮状单位标准品来测定类毒素的絮状单位。•絮状单位测定毒素或类毒素与相应抗毒素在适当的含量、比例、温度反应时间等条件下可在试管中发生抗原抗体结合，产生肉眼可见的絮状凝集反应，根据抗毒素絮状单位标准品可测定类毒素的絮状单位（Lf）值。七、类毒素的质量检定•纯度：≥1500Lf/mgPN•安全性试验（豚鼠）•效价测定（即类毒素刺激机体产生特异性抗体的免疫应答和对相应抗体的特异性结合反应）。将标准和待检类毒素不同倍数稀释，免疫小鼠或豚鼠后用毒素攻击，对动物的保护率≥80％；或用vero细胞检测血清中的抗体滴度。伤寒疫苗一、概述二、伤寒疫发展简史三、伤寒Vi疫苗一、概述•伤寒病的定义•临床症状•病原学•血清学诊断伤寒病的定义伤寒病是一种急性全身性感染，感染网状内皮细胞系统，肠道淋巴组织及胆囊，病原是伤寒沙门氏菌。典型的临床症状1潜伏期为7～21天病期为一个月，恢复缓慢。3表情迟钝脉搏相对缓慢，肝脾肿大和白细胞减少。2长期发热、持续高烧达10～14天、腹部不适、头痛等。2长期发热、持续高烧达10～14天、腹部不适、头痛等。病原学1.伤寒沙门氏菌是革兰氏阴性杆菌，需氧，有鞭毛，能运动。2.在普通培养基上以易生长，适宜的pH为7.0～7.2。3.伤寒沙门氏菌的抗原构造有O.H.及Vi抗原。抗原结构1鞭毛（H）抗原：为蛋白质，煮沸破坏，不受（1％）甲醛影响。2菌体（O）抗原：细胞壁部份，耐热，为脂多糖（LPS）－由多糖（重复寡糖和核心寡糖）和类脂A组成。3莢膜（Vi）抗原:即荚膜多糖（CPS）,是伤寒杆菌细胞外壁的一种荚膜抗原,Vi抗原与其致病性有关Vi来源于毒力的缩写。血清学诊断肥达氏试验（widaltest）:两种选择抗原的方法：1用伤寒0901株（没有H和Vi抗原）测定O抗体；用伤寒S株（没有O菌体抗原）测定H抗体。2用甲醛处理伤寒沙门氏菌破坏O抗原（耐热）测定H抗体；用加热杀菌破坏H抗原（不耐热）测定O抗体。二、伤寒疫苗的发展简史1234全菌体灭活疫苗口服Ty21a减毒活疫苗伤寒Vi多糖疫苗伤寒结合疫苗全菌体灭活疫苗1甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗2.加热杀菌石碳酸防腐疫苗3.丙酮杀菌疫苗甲醛杀菌石碳酸防腐疫苗50年代初期学自前苏联，为伤寒、副伤寒甲乙三联疫苗。用１％甲醛杀菌，0.5％石炭酸生理盐水制成。每毫升含伤寒沙门氏菌体原为１０亿，后改为５亿；副伤寒甲乙由每毫升各５亿改为各２.5亿，细菌总量原三联疫苗为20亿，现为10亿。加热杀菌石碳酸防腐疫苗此法历史最久，1896年首创的伤寒疫苗即为此法制成，只用56℃水浴30ｍin杀菌加石碳酸防腐制成。美国仍用此法制作标准品。丙酮杀菌疫苗1921年创制，认为对稳定Vi抗原有益，系将一份菌液加三份丙酮处理，然后抽气干燥制成。1943年首次在意大利使用，经世界卫生组织做现场考核，认为效果最好。伤寒、副伤寒甲乙三联疫苗接种反应实践证明，菌体疫苗预防伤寒效果肯定的，但接种后的严重反应一直困扰着人们。观察组观察人数中强反应百分率(%)第一组1408856.05第二组131315111.50合计27212368.75口服Ty21a疫苗70年代末期研究成功的口服伤寒疫苗Ty21a活疫苗，是以Ty21伤寒毒株作为出发株，用亚硝基胍诱变所得的突变株。口服Ty21a疫苗的特点1此突变株没有半乳糖异构酶,半乳糖激酶和半乳糖转移酶的活性降低约80％，且没有Vi抗原。所以其毒力减低，但此突变株有完整的O抗原LPS，并具有免疫原性，能诱导较好的免疫保护性反应。2经过多年观察证明有效，反应也较轻。一些国家批准应用。口服Ty21a疫苗的特点3Ty21a菌株营养要求苛刻，生长缓慢，产量很低，不易批量生产。4目前无可靠的检定指标。5基因背景不够清楚，因为它是用强诱变剂处理而得，作为活疫苗这是它的最大的弱点。口服Ty21a减毒活疫苗的免疫效果地区疫苗制剂效果效果比较埃及液体＋NaHco396%智利肠溶衣胶囊／明胶囊66％ECC19％明胶ECC＞明胶智利液体／胶囊35%ECC76%液体液体＞ECC印尼液体／胶囊42%ECC53%液体液体＞ECC三、伤寒Vi多糖疫苗•伤寒Vi多糖疫苗的概述•伤寒Vi多糖疫苗的免疫效果•伤寒Vi多糖疫苗不良反应观察结果•伤寒Vi多糖疫苗的制造工艺•伤寒Vi多糖疫苗的特点伤寒Vi多糖疫苗概述•由于Vi抗原是一种表面抗原，是由C3位乙酰化的N-乙酰-D-半乳糖醛酸（1－4）连接的同聚体。•在美国NIH的Robbins等重新认识伤寒Vi抗原的免疫原性后，并受流脑多糖疫苗的启发，用与之类似的方法提取Vi抗原，以不伤害其抗原结构，保持它的免疫原性，制备了伤寒Vi多糖疫苗。伤寒Vi多糖疫苗概述•早期提取Vi抗原时为了降低LPS的含量，采取1mol/L乙酸100℃处理24h，使O-乙酰基和N-乙酰基脱落造成Vi抗原结构变化，导致其免疫原性发生变化。•新方法是用十六烷基三甲基溴化铵处理伤寒沙门氏菌，所得Vi抗原可以保留O-乙酰基和N-乙酰基，使其不变性。伤寒Vi多糖疫苗的免疫效果观察地区疫苗人数观察时间（月）保护率（％）尼泊尔伤寒Vi3457（5～44岁）1772南非伤寒Vi5692（5～16岁）2164伤寒Vi多糖疫苗不良反应观察结果疫苗局部反应发热率(%)疼痛红肿硬结流脑A+C多糖（50μg/人）N=12989（69％）23（18％）21（16％）2（2％）伤寒Vi（25μg/人）N=12778（61％）10（8％）2（2％）1（1％）伤寒Vi（50μg/人）N=12686（68％）9（7％)9（7％）0（Ty2株）细菌培养生物反应液体培养（8～10h）对数生长期末收获,甲醛液灭活离心去菌体，收上清液浓缩多糖上清加10%十六烷基三甲基溴化铵离心收集沉淀，加氯化钙溶液振荡解离除去核酸加95%乙醇至25%浓度收集上清上清中加95%乙醇至80%浓度沉淀粗制多糖，抽干除去蛋白加1：10饱和中性醋酸钠溶液溶解多糖按1：2加冷酚提取3次，离心收集上清液并透析去内毒素梯度离心透析液加95%乙醇至80%沉淀用无水乙醇和丙酮各洗3次原液注射用水溶解多糖并除菌注射用水稀释分装成品伤寒Vi荚膜多糖疫苗工艺流程示意图伤寒Vi多糖疫苗检定项目及检定指标检定项目检定指标固总测定％蛋白含量＜10mg/g核酸含量＜20mg/gO－乙酰基含量≥2mmol/gKd值≤0.25Kd值＜0.25回收率＞50%热原检查0.025μg/kg伤寒Vi多糖疫苗的特点•安全有效，没有菌体疫苗那么多的副反应，但却有其大致相同的免疫效果。•稳定性好，即可以为液体制剂，也可以为冻干制品，耐热，易于运输与保存。•使用方便，注射一针，即可以有一定的保护力，易于用理化方法标准化。•同其他多糖疫苗一样对婴幼儿免疫效果差。结合疫苗一、结合疫苗的定义二、免疫机理三、用于制备结合疫苗的多糖抗原四、用于制备结合疫苗的蛋白载体五、结合化学制备结合疫苗的主要要素六、结合疫苗应具备的两个共同特征七、结合疫苗的使用和发展现状八、结合疫苗的研究方向九、存在问题一、结合疫苗的定义•抗原物质（多糖和蛋白质）经化学共价结合形成了具有一定空间构象的结合物。抗原物质还包括多肽、甾族激素、脂肪胺、核苷等小分子物质。结合疫苗的特点•它能使多糖抗原的T细胞非依赖性转化为T细胞依赖性,产生具有记忆特征的IgG抗体,提高多糖疫苗的免疫原性和免疫持久性。•能够在婴儿产生免疫应答。二、免疫机理•胸腺依赖性抗原（TD-Ag）•胸腺非依赖性抗原（TI-Ag）二、免疫机理•胸腺依赖性抗原（TD-Ag）•胸腺非依赖性抗原（TI-Ag）胸腺依赖性抗原（TD-Ag）•绝大多数天然抗原（蛋白质）都是TD-Ag;•此类抗原含有T细胞和B细胞决定簇，虽然能与B细胞受体结合，但单独不足以激活B细胞，需T细胞辅助才能激活B细胞产生抗体；•TD-Ag分子量大，结构复杂，表面决定簇种类多，但决定每种决定簇的数量不多且不均匀(就每种表位而言它是单价的)；•诱导体液免疫应答，同时诱导细胞免疫应答和免疫记忆。B细胞对（TD-Ag）应答特点•TD-Ag需TH细胞辅助；•浆细胞在产生抗体中发生Ig类型转换，主要产生IgG类抗体；•形成记忆B细胞，当受到相同抗原再次刺激时引起再次应答，而且抗体亲和力较初次应答明显提高。B细胞对（TD-Ag）应答特点TD-AgIgGIgMTH细胞细胞因子B2Bm停止分化胸腺非依赖性抗原（TI-Ag）•细菌脂多糖、荚膜多糖等；•T