3-基因工程的酶学基础

1第二章基因工程的酶学基础Enzymes2本章节内容第一节限制性核酸内切酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶第四节DNA修饰酶第五节核酸外切酶第六节单链核酸内切酶3本章学习内容重点讨论限制性核酸内切酶和DNA连接酶在DNA切割和连接中的应用，并简要介绍其他与基因克隆有关的其它的重要的酶。4一、限制性核酸内切酶第一节限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。（Restrictionendonuclease）52.性质内切酶主要来源于原核生物即在核酸分子链的内部制造切口的酶。形成5’-P和3’-OH末端自我保护作用3.功能细菌的限制和修饰系统（R/M体系）1.来源67限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分解，切成小片断。（1）限制（Restriction）8细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。（2）修饰（Modification）①Dam甲基化酶(DNAAdenineMethylase)GATC腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶(DNAcytosineMethylase)CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基910（3）限制与修饰系统相关的三个基因①hsdR:编码限制性内切酶②hsdM:编码限制性甲基化酶③hsdS:编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达这类酶能识别DNA分子上的特定位点，并将双链DNA切断这类酶使DNA分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰DNA的作用。作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。111973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：二、限制性内切酶的命名1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名，组成酶的基本名称。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示122.如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。如HindⅡ：d菌株EcoRI：抗药性R质粒133.如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。如HindⅡ：d菌株中发现的第二个酶4.所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称。限制性内切酶的系统命名为R，甲基化酶为M。如R.HindⅢ表示限制性内切酶M.HindⅢ表示相应的甲基化酶实际应用中，R常被省略。14Ⅰ型限制性内切酶目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。主要的三种：三、限制性内切酶的类型Ⅱ型限制性内切酶Ⅲ型限制性内切酶15首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的。（1）识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.Ⅰ型限制性内切酶的基本特性如EcoB和EcoK。未甲基化修饰的特异序列。16需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）（3）辅助因子在距离特异性识别位点约1000—1500bp处随机切开一条单链，不产生特异片断，应用不大Recognizesitecut1-1.5kb（2）切割位点17首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是呈典型的旋转对称型的回文结构）。与DNA的来源无关，即没有种的特异性。2.Ⅱ类限制性内切酶的基本特性分离的第一个酶是HindⅡ基因工程用途最大18稀有切割限制酶（rarecutter）可以识别6个以上的核苷酸序列的少数的限制内切酶。如NotI（GCGGCCGC）某些限制性内切酶的识别序列中，某一个或两个碱基并非严格专一。如HindⅡ可识别4种核苷酸序列：Y:C或TR:A或GGTYRAC-3’5’-19EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’产生平齐末端（2）切割位点切开双链DNA，形成粘性末端（stickyend）或平齐末端（bluntend）。如：识别位点处20含有几个核苷酸单链的末端。分两种类型：GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’[1]粘性末端（stickyends，cohensiveends）ⅰ）5’端凸出（如EcoRI切点）21CTGCAGGACGTC5’--3’3’--5’5’--3’3’--5’CTGCAGGACGTCⅱ）3’端凸出（如PstI切点）22i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。这比连接两个平齐末端容易得多。[2]粘性末端的意义①连接便利2324B末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性末端。A末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。②末端标记③补平成平齐末端25[3]平齐末端（bluntend）在识别序列的对称轴上同时切割5’-GATATC-3’3’--5’CTATAG如EcoRV26[4]平齐末端的特点连接困难，连接效率低，只有粘性末端连接效率的1%，这种连接常出现多联体连接。粘性末端与平齐末端连接的处理方法ⅰ）添补法：利用DNA聚合酶Ⅰ(klenowfragment）将碱基添补到目的基因的粘性末端上。27ⅱ）削除(平)法利用S1和Bal31等核酸酶将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端28不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式相同或不同。识别位点和切点完全相同如HindⅢ和HsuIHindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’[5]同裂酶（Isoschizomer)①完全同裂酶：29XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’识别位点相同，但切点不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶：30识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。[6]同尾酶(Isocaudamers）315’-GATC----3’3’----CTAG-5’Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。5’-G3’-CCTAGGATCT-3’A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A32限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。[7]限制酶的酶活性①星号（*）活性33EcoRI和BamHI等都有*活性。在低盐、高pH（8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等GAATTCEcoRI：使用的时候要特别注意！734②诱发星号（*）活性的原因ⅰ）高甘油含量ⅱ）内切酶用量过大ⅲ）低离子强度ⅳ）高pHⅴ）含有机溶剂，如乙醇ⅵ）Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二价阳离子的存在酶量不宜过多，尽量遵循生产商推荐的反应条件35在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。移动切割（shiftedcleavage):GACGCNNNNNHgaICTGCGNNNNNNNNNN5’3’[8]Ⅱs型限制性内切酶36（3）Ⅱ型限制性内切酶不具有甲基化功能Ⅱ型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。它们识别相同的DNA序列，但功能不同。如EcoRI限制性内切酶和EcoRI甲基化酶前者：5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’后者：5’-GAA*TTC-3’3’-CTT*AAG-5作用的位点也不相同37（4）II型限制性内切酶对单链DNA的切割定义为切割双链DNA，但有一些还可以特异识别并切割单链DNA的相应位点，只是切割效率比较低如：HhaⅠ切割单链DNA比切割双链DNA效率低50％383.Ⅲ类限制性内切酶在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG39核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性Ⅰ类内切酶Ⅱ类内切酶Ⅲ类内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基限制作用所需要的辅助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM寄主特异性位点识别序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列（Ⅱs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG40切割位点在距离识别位点至少1000bp处随机切开一条单链位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3’端24－26bp处酶催转换不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别未甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用用处不大41四、限制性内切酶酶解反应条件1.标准酶解体系的建立一个单位（U）的限制性内切酶定义：在合适的温度和缓冲液中，在20μl的反应体系中，1h完全酶解1μgDNA所需要的酶量。推荐：稍过量的酶（2-5倍）和较长的反应时间422.酶解过程配酶解体系混匀反应终止酶解结果鉴定43①酶解体系一般20μl，保证酶液体积不超过反应总体积的10%前提下，尽量降低反应总体积。加样顺序一般是：ddH2ObufferDNA酶44大部分II型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低盐酶100mM中盐酶150mM高盐酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr45②混匀移液枪吹打或手指轻弹管壁若底物分子很大（如基因组DNA），应避免强烈振荡。混匀后微量高速离心机进行短暂离心，使管壁液体全部下沉。46③反应终止三种方法：ⅰ）加乙二胺四乙酸（EDTA）至终浓度10mmol/L;加十二烷基硫酸钠（SDS）至终浓度0.1%(W/V)ⅱ）65℃加热20min或者70℃加热10minⅲ）酚/氯仿抽提47④酶解结果鉴定快速进行微型琼脂糖凝胶电泳观察然后决定是否终止反应48酶切后发现除了目的DNA条带外，还有其它条带酶存在“星号”活性，造成非特异性切割；不正确的操作，导致其它内切酶污染；底物DNA中可能存在其它DNA污染。电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常底物DNA不纯；内切酶不纯；酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNA结合在一起使电泳条带移动距离异常493.限制性内切酶对DNA分子的消化1986年J.A.McClarin等通过X射线晶体衍射发现Ⅱ型限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。CTTAAGGAATTC（1）内切酶与识别序列的结合模式50内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开12341234（2）完全消化51只有有限数量的酶切位点被切开通过缩短保温时间、降低反应温度、增大反应体积或减少酶量可达到局部消化的目的。123414（3）局部消化52（4）几种常用限制酶识别位点53