4 基因工程操作技术

Chapter4DNA操作技术学习内容：DNA操作酶–核酸酶–连接酶–聚合酶–DNA修饰酶限制性内切酶–分类和命名–酶切体系、反应条件、结果鉴定–定位酶切位点连接1.1核酸酶作用：降解磷酸二酯键分为：外切酶内切酶1.DNA操作酶1.1核酸酶Bal31(来自于细菌Alteromonasespejiana)单链特异的核酸内切酶活性，双链特异的外切酶活性。依赖于Ca2+用途：构建限制酶图谱产生末端缺失突变DNA超螺旋线性化1.1核酸酶来自于真菌Aspergillusoryzae的S1内切酶作用于单链DNA或RNA。用途：分析内元的位置获得平端ds-DNA酶量大时，降解双链DNA1.1核酸酶来自于牛胰腺的DNaseI既可以降解单链也可以降解双链，没有特异性，产生单核苷酸或短链。DNAFingerprintingwithDNaseI1.1核酸酶RNaseH（E.coli）–降解RNA:DNA杂交分子中的RNA。1.2连接酶连接3‘端羟基和5’端磷酸形成磷酸二酯键。在DNA复制、修复、以及体外重组过程中起重要作用。1.2连接酶T4-DNA连接酶–连接粘性末端、平端–修复双链DNA或RNA-DNA杂交双链上的缺口。E.coliDNA连接酶–连接粘性末端（主要用于cDNA第二链的合成）1.3聚合酶DNA聚合酶I–5’-3’聚合酶活性–3’-5’外切酶活性–5’-3’外切酶活性–核酸内切酶活性可以被枯草杆菌蛋白酶水解成：Klenow片段和N端具5’-3’外切酶活性的分子。1.3聚合酶1.3聚合酶Klenow酶–修复限制性内切酶造成的粘端–标记DNA探针–催化cDNA第二条链的合成–末端终止法测序1.3聚合酶T4DNA聚合酶–与Klenow酶相似，外切酶活性更高。体外诱变反应中效率很高。T7DNA聚合酶–测序酶TaqDNA聚合酶1.3聚合酶逆转录酶：将mRNA转录成cDNA–AMV逆转录酶（鸟类成髓细胞性白血病病毒）–M-MLV逆转录酶（Moloney鼠白血病病毒）1.4DNA修饰酶碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道）可以去掉DNA分子的5‘端的磷酸基团。polynucleotidekinase:来自于T4侵染的大肠杆菌，在5’端增加磷酸基团。末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyltansferase）来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3‘端增加一个或多个脱氧核苷酸。甲基化酶与限制性内切酶具有相同的识别序列。1.4DNA修饰酶碱性磷酸酶（BAP,CIP）–作用于载体的5’端，提高重组效率–作用于外源DNA的5’端，防止自连1.4DNA修饰酶T4--多核苷酸激酶（T4-PNP）–将γ-磷酸转移到DNA或RNA的5’端–放射性标记DNA的5’端–连接反应中，使缺少5’端磷酸的DNA片段和接头磷酸化1.4DNA修饰酶末端脱氧核苷酰转移酶（TDT）–3’端突出的双链DNA，Mg2+–平端或3‘凹端的低物，Co2+1.5拓扑异构酶在共价闭合双链上通过磷酸二酯键的短暂断裂和重新连接解开超螺旋2限制性内切酶限制-修饰现象2.1限制性内切酶的发现限制-修饰现象1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，HindII和HindIII，为基因工程技术的诞生奠定基础。2.2限制性内切酶分类限制性核酸内切酶可分为三大类：–I类–II类*–III类I类限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割,但是切割的核苷酸顺序是随机的。代表EcoB、EcoK(II型)限制性内切酶•能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。•II型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序(palindrome)，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。III型限制性内切酶•有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。2.3限制性内切酶的命名原则命名原则：取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称。该种中发现的不同的酶按照顺序编号I,II,III等。如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母。若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。PvuI识别CGATCG，PvuII识别CAGCTG,都来自于Proteusvulgaris。HindIII是在Haemophilusinfluenzaed株中发现的第三种酶。EcoRI表示基因位于Escherichiacoli中的抗药性R质粒上。2.4限制性内切酶产物钝端（平端）粘性末端2.4限制性内切酶产物同位酶（Isoschizomers）:识别序列相同但切点不同的酶。同尾酶：识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列。2.4限制性内切酶产物2.4限制性内切酶产物同裂酶（同切酶或异源同工酶）：识别位点与切割位点均相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……G’CG_G……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。2.4限制性内切酶产物星号活力（第二活性）–PH–离子强度–甘油浓度过高≥10%时–酶量2.5DNA分子中识别位点的数目四碱基的酶平均大约每256个核苷酸（44）有一个识别位点，而六碱基的酶大约4096（46）个核苷酸有一个识别序列。λDNA长49kb，对于六碱基的酶应该有12个切割位点。如BglII只有6个，BamHI只有5个，而SalI只有2个，意味着λDNA中GC含量少于50%。2.5DNA分子中识别位点的数目识别碱基多为6，也有的4、5、8Sau3A来自于Staphylococcusaureus品系3A，识别GATC。有的酶识别兼并序列，如HinfI来自于Haemophilusinfluenzae品系Rf，识别GANTC，N代表A,G,T,C。2.6反应程序体系：DNA分子（溶液）酶缓冲液（一般pH值7.4,含Mg2+,NaCl,还原剂如DDT稳定酶阻止失活）水1U定义为在最佳缓冲系统和20ul体积中反应1小时，完全水解1μgDNA所需的酶量反应条件一般为37°C，也有例外，如TaqI在65°C时活性最高。2.6反应程序1）加入DNA2）加入Buffer3)加入酶4）37°C保温1hr或过夜5)反应终止，70°C加热、加入EDTA、或加入苯酚2.7酶切结果分析通过凝胶电泳分离，根据分子量分离。–聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离1-300bp的分子。–琼脂糖凝胶电泳Standardelectrophoresis(a)doesnotseparateDNAfragmentsofdifferentsizes,whereasgelelectrophoresis(b)does2.7酶切结果分析DNA分子的检测–EB染色，DNA分子小于25ng，很难检测到–放射性自显影。可检测2ngDNA。–银染放射性自显影显示DNA条带2.8估计DNA分子的大小D=a-b(logM)D:移动距离，M:分子量，a,b是恒量。与已知大小的片段进行比较，误差约5%。Figure4.16EstimationofthesizesofDNAfragmentsinanagarosegel.Figure4.17UsingarestrictionmaptoworkoutwhichrestrictionendonucleasesshouldbeusedtoobtainDNAfragmentscontainingindividualgenes.2.9绘制DNA分子的酶切图谱确定每一种酶切后产生片段的分子量和数目。进行双酶切。比较单酶切和双酶切结果，绘制酶切图谱。含糊的位点可以通过部分酶切解决。绘制酶切图谱绘制酶切图谱绘制酶切图谱2.10多酶联合酶解对离子强度要求相同的酶，可同时酶解。对离子强度要求不同的酶：–低盐浓度的酶先切，后补加NaCl–一种酶切后，沉淀DNA，换缓冲液。Figure4.19Ligation:thefinalstepinconstructionofarecombinantDNAmolecule.3连接Figure4.20ThedifferentjoiningreactionscatalysedbyDNAlligase.外源DNA与载体DNA的连接相同粘性末端的连接平头末端的连接不同粘性末端的连接人工粘性末端的连接粘性末端的更换3.1相同粘性末端的连接来源–相同的酶–同尾酶问题–极性有两种可能–同尾酶连接后，不能用任何一种酶酶切。称为“焊死”。同种内切酶生产的粘性末端的连接5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRI5'GCTTAAAATTCG5'5'GCTTAA5'5'AATTCG5'退火GCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTCGGCTTAAAATTCG5'GCTTAA5'AATTCGT4-DNAligaseGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'5'GAATTCCTTAAG同尾酶生产的粘性末端的连接退火GCCTAGGATCCG5'TACTAG5'GATCAT5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'TGATCAACTAGT5'BamHI5'GCCTAGGATCCG5'5'TACTAG5'5'GATCAT5'BclIGCCTAGGATCCG5'TACTAG5'GATCATT4-DNAligaseTGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGTTGATCCACTAGG5'5'GGATCACCTAGT不同酶的相同粘性末端的连接退火GCCTAGAATTCG5'GCTTAA5'GATCCG5'GAATTCCTTAAGGATCCG5'5'GCTTAA5'EcoRIBamHIBamHI5'5'GGATCCCCTAGG5'GCCTAGAATTCG5'EcoRIT4-DNAligaseGCCTAGAATTCG5'GCTTAA5'GATCCG3.2平头末端的连接粘性末端--分子内部连接，平头末端--分子间的连接。提高连接效率的方法：–加大酶用量（10倍）–加大平头末端底物的浓度–加入10%PEG（8000），促进分子间的有效作用–加入单价阳离子，150-200mMNaCl–提高反应温度平头连接同样存在两种极性3.3不同粘性末端的连接突出5'末端–Klenow补平，或S1核酸酶切平，然后平头连接突出3'末端–T4-DNApol切平，然后平头连接突出末端不同–Klenow补平，或S1核酸酶切平连接后，可能恢复限制性位点，甚至还可能产生新的位点。XbaI与HindIII（XbaI恢复），XbaI与EcoRI（均保留），BamHI与BglII（产生ClaI位点）不同粘性末端的连接T4-DNAligaseCGATCCGCTAGG5'5'GGATCGCCTAGC5'5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'CTGCAGGACGTC5'BamHIPstI5'GCCTAGGATCCG5'5'CTGCAG5'GACGTC3'3'T4-DNApol切平5'CG5'GCKlenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'CTAGG3.4人工粘性末端的连接5'突出的末端–外源片段先用Klenow补平；然后用TdT补加polyC；载体片段也用Klenow补平，加polyG，退火不经连接即可转化。目的是：不使酶切位点遭受破坏。3'突出的末端–外源片段先用TdT加polyG；载体片段加polyC；然后退火；再用Klenow补齐；连接平头末端–可直接用TdT补加末端，但以加polyA/T为佳。这样稍微加热，AT区就会出现单链区域，然后用S1核酸酶水解即可回收片段人工粘性末端的连接5‘突出末端5'Klenow补平Klenow补平5'GGATCCCTAGGATCC5'CTAGG5'GAATTCTTAA5'5'5'AATTCTTAAGTdTTdTdGTPdCTPGAATTGGGGGGCTTAAAATTCGGGGGGTT