CH7-gangan-基因工程

厚德博学精诚济世生物化学第九章糖代谢基因工程技术Geneengineeringtechnique生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世主要内容概述工具酶载体目的片断的制备目的片断与载体的重组重组子导入宿主细胞阳性克隆的筛选及鉴定克隆基因的表达基因工程技术的应用生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世基因工程技术流程“木工”兼“泥瓦匠”生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世基本概念限制性内切酶、连接酶、AP、重组酶等载体转化/转染重组/重组子/重组DNA基因工程生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世重组DNA(recombinantDNA)重组：染色体内或间进行片断交换的现象对不同生物的DNA，在体外用工具酶，进行“剪切”、“组合”、“拼接”，使DNA按照我们的意愿重新组合。然后通过运载物质（质粒、噬菌体、病毒等统称载体）转入微生物、动、植物宿主细胞内，进行无性繁殖，使我们需要的基因在细胞中表达，产生出我们所需要的产物或组成新的生物类型指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世基因工程基因工程即指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两部分。上游技术是指基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）。下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世生物工程基因工程细胞工程蛋白质工程酶工程微生物工程分子克隆技术重组DNA技术上游技术DNA转移技术下游技术工程菌(细胞)克隆表达技术分离纯化技术生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世基因工程主要内容基本工具基本操作程序应用生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世基因工程----理论和技术背景基础理论上的三大发现证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导）DNA的双螺旋结构和半保留复制机理遗传信息传递(中心法则)和密码子系统的建立技术上的三大发现限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）载体的使用1970年，逆转录酶的发现生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世限制性内切酶发现及应用1968年阿尔伯首次成功分离出I型限制性内切酶（RE）；1970年史密斯分离出II型RE；同年内森斯用II型RE首次完成了对基因的切割。他们于1978年获诺贝尔医学和生理学奖。阿尔伯(1929～)瑞士微生物遗传学家H.O.史密斯(1931～)美国分子生物学家、遗传学家内森斯(1928～)美国微生物遗传学家生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世基因工程技术的关键DNAligase(glue):1967Restrictionenzyme(scissors):1970Geneticengineeringvector:1973生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世基因工程的诞生第一个重组DNA分子和重组的生物体1972年，美国斯坦福大学P.Berg把SV40的DNA和λPhageDNA分别切割，又将两者连在一起，成功地构建了第一个体外重组的人工DNA分子，于1980年获诺贝尔化学奖1973年，S.N.Cohen(科恩)等获得了抗四环素和新霉素的重组菌落TcrNer，完成了体外DNA重组和扩增的全过程，标志着基因工程的诞生1973年为基因工程元年生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世Cohen等进行DNA体外重组实验PSC101：抗药质粒R6-3：抗药质粒Ner：抗新霉素基因Sr：抗黄胺基因Tcr：抗四环素基因rcTreNSrSrNerTcrPsc101R6-3ECORIECORI转化E.coli连接酶生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世BoyerandCohenP.伯格(1926～)美国生物化学家重组DNA技术的开拓生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世基因工程的发展基因工程的艰难阶段关于基因工程的争议：起因：产物是生物，即具有巨大的理论和实践意义，又具有非常大的危害性。焦点：基因工程产生的杂种生物和基因的扩散问题，列如：产生的有害微生物和病毒如果逸出的问题、产生的高等植物的花粉传播问题等等从1972年到1976年，人们对DNA重组所涉及的载体和受体系统进行了有效的安全性改造，包括噬菌体DNA载体的有条件包装以及受体细胞遗传重组和感染寄生缺陷突变株的筛选，建立了一套严格的DNA重组试验室设计与规范操作生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世基因工程的发展基因工程的逐渐成熟阶段1977年，日本科学家首次在大肠杆菌中克隆并表达了人生长激素释放抑制素基因，首次实现真核基因的原核表达随后，美国的Ullvich克隆并在大肠杆菌中表达了人胰岛素基因1978年，美国Genentech公司开发出利用重组大肠杆菌合成人胰岛素，1982获准使用。生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世基因工程的发展1982世界上第一只转基因动物---“巨鼠”1985第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国水生所转基因鱼1990HGP实施1993基因工程西红柿在美国上市1997英国罗斯林研究所多莉羊2000人类基因组草图绘制完成生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世转基因动物生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世基因工程的操作流程分：目的基因和载体的获得切：目的基因和载体的限制性酶切连：目的基因和载体的连接(体外重组)转：连接产物(重组体)导入宿主细胞筛：重组体的扩增、筛选目的基因在细胞的表达、分离、纯化、鉴定等厚德博学精诚济世生物化学第九章糖代谢一、目的基因的获得生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世目的基因的获得PCR方法获取：化学合成法：要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列局限性：短片段、简并性、高费用生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世目的基因的获得基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。基因牛文库构建流程图生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世目的基因的获得cDNA文库：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库(cDNAlibrary)生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世组织或培养细胞载体mRNAcDNAcDNA与载体连接导入大肠杆菌鉴定cDNA文库的克隆数与特征cDNA文库构建流程厚德博学精诚济世生物化学第九章糖代谢二、重组DNA导入受体细胞生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世感受态细胞感受态：指受体(或宿主)处于最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态感受态细胞（E.coil）的制备划线：将宿主菌在LB平板上划线，37℃培养O/N挑单克隆：挑约3个单菌落接入3mlLB中，37℃振荡过夜放大：从中取1ml菌液转入200mlLB中37℃振荡培养4-5h，测OD600达0.4-0.5收集：菌液于冰水中摇10min，转入50ml离心管，4℃,4000rpmX10min洗涤：菌块加30ml冰预冷的0.1MCaCl2，置冰上10min，离心洗涤分装：菌块加入适量的0.1MCaCl2悬浮细胞，100ul/1.5EP分装冻存生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世转化(transformation)：在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新遗传特性的一种方法。转染(transfection):指病毒或以它为载体构建的重组子导入到真核细胞的过程。重组DNA导入受体细胞生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世重组DNA导入受体细胞感染(infection):以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。转导(transduction):指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世重组DNA导入受体细胞重组体导入大肠杆菌氯化钙法电穿孔法(electroporation)病毒感染法/体外包装法生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世氯化钙转化法附着：在1.5mlEppendorf管中加入100μl感受态细胞和10μl40ngDNA溶液，温和混匀，于冰上50min。热激：于42℃水浴90S。冷激：冰浴2min。复苏：加500μlLB液体培养基37℃x50min涂皿：取适量菌液涂布于含相应抗生素的琼脂糖平皿，37℃培养过夜，观察结果。生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世电穿孔法+Electrode1Electrode2+++++++++++++++NoVoltageMedium(conductivity=)Membrane生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世+Electrode1Electrode2++++++++++++++++Voltage-Medium(conductivity=)MembraneVoltageAcrossMembrane=charge/capacitanceplusminus电穿孔法生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世DNAMovement+++___________________________________________________电穿孔法生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世电转仪生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世重组DNA导入受体细胞重组体导入哺乳动物细胞脂质体介导法：人工细胞膜（培养细胞）病毒感染法（腺病毒）显微注射法（转基因）磷酸钙共沉淀法厚德博学精诚济世生物化学第九章糖代谢三、DNA重组体的筛选与鉴定生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世DNA重组体的筛选与鉴定根据重组载体的表型进行筛选普通抗菌素平板筛选:(Amp+、Kan+、Cl+）报告基因：（荧光蛋白等）插入失活筛选：α-互补——蓝-白斑筛选：含LacZ基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源DNA插入后，LacZ基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌，称之为蓝-白斑筛选生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世蓝白筛选IPTG：诱导LacZ及LacZ’(F因子上)表达X-gal：(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)β半乳糖苷酶底物水解显色生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世DNA重组体的筛选与鉴定DNA限制酶切图谱分析bp—1534—994—695—515—377—237ABCM生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世DNA重组体的筛选与鉴定PCR鉴定（菌落PCR）利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定厚德博学精诚济世生物化学第九章糖代谢基因工程的工具酶生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世基因工程常用的工具酶工具酶活性限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNA连接酶催化5'-磷酸与3'-羟基形成磷酸二酯键DNA聚合酶以DNA为模板合成DNARNA聚合酶(逆转录酶)以RNA为模板合成DNA碱性磷酸酶切除末端磷酸T4多聚核苷酸激酶催化核酸5'-羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶催化3'-端合成同聚体尾生物化学第九章糖代谢厚德博学精诚济世限制性核酸内切酶概念：是由细菌产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸链中磷酸二酯键的核酸内切酶，又叫切割酶或限制酶。分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。以Ⅱ型为主。命名原则：生物化学第九