Chapter 1 酶与酶工程

第一章酶与酶工程第一节酶的基本概念与发展史（一）酶与酶工程酶（enzyme）：由活细胞产生的具有生物催化功能的生物大分子。酶工程(enzymeengineering)：酶的生产、应用的技术过程。★酶工程已在工业、农业、医药、食品等方面有广泛应用，并在资源、能源、环保等方面起着举足轻重的作用。（二）酶的发展史1、酶在古代的应用★早在4000年前的周朝，我国人们就不自觉地将酶的催化作用应用于酿酒、制酱工业。★一种古老的酶技术（酒曲）从远古时代被用于豆制品调味料(豆面酱)和发酵饮料(米酒、酒精)的生产，并且一直沿用到今天。★蒸过的米加入霉菌混合物就能得到酒曲，这项技术世代相传。2、酶学研究的历史★最早的酶学实验：1783年，意大利科学家Spallanzani发现鸟的胃液能分解消化肉类。斯帕兰扎尼（Spallanzani）他用自己饲养的山鹰做了一个十分耐人寻味的实验。他将一块生肉塞进一个上面布满许多孔眼的金属小管子里，管子两端盖紧，不使肉掉下来，然后迫使山鹰吞下小管。过一段时间再设法取出小管。小管依然完好无损，盖子仍牢牢地固定在小管上，但是管中的肉不见了，只留下一些淡黄色的液体，这使斯巴兰沙尼惊讶不已。这恐怕要算最早的酶学实验。虽然他未说明此物为酶，但后来有人还是把他看作是酶的最早发现者。★酶水解作用的发现：1814年，德国物理学家Kirchhoff研究了酶的水解现象。基尔霍夫（Kirchhoff）发现淀粉经稀酸加热后可水解为葡萄糖，而某些谷物种子在发酵时也能生成还原糖。若把种子发芽时的水提取物加到泡在水里的谷物中，也能发生相同的水解反应，很显然，活的谷物种子的水解能力取决于包含在其中的水溶性物质，这种水溶性物质脱离了生物体后仍能发挥作用。★最早的酶制剂：1833年，法国化学家Payen和Persoz得到了diastase。佩恩（Payen）和帕索兹(Persoz)他们从麦芽的水抽提物中，用酒精沉淀得到一种可使淀粉水解成可溶性糖的物质，称之为淀粉酶（diastase['daiəsteis]）。并指出了它的热不稳定性，初步触及了酶的一些本质问题。★首次证明催化：1835年，瑞典化学家Berzelius证实用麦芽提取物可以比硫酸更有效地降解淀粉，并将这一过程称为催化。人们从19世纪30年代开始才真正认识酶的存在和作用●19世纪中叶，法国微生物学家Pasteur指出酵母中存在使葡萄糖转化为酒精的物质。●1878年，德国科学家Kunne给酶起名叫enzyme。Kunne给酶起名叫enzyme['enzaim]源于希腊文，由“En（在）”和“Zyme（酵母）”二字组合，表示酶包含在酵母中。当时用于区别那些有机酵素(OrganizedFerments，指整个微生物细胞)和非有机酵素(UnorganizedFerments，指从有机体得到的抽提物)。●1898年，Duelaux提出引用“ase”作为酶命名的词根。Duelaux提出引用diastase的最后三个字母“ase”作为酶命名的词根。例如：oxide→oxidase['ɔksideis]（氧化酶），pectin→pectinase（果胶酶）★发酵机制的争论：19世纪中叶，德国化学家Liebig和Pasteur围绕着发酵机制的争论。德国化学家利比克（Liebig）和Pasteur围绕着发酵机制的争论，持续了数十年。前者强调发酵是纯化学反应，后者则坚持发酵是活酵母参与的结果。●1896年，Buchner兄弟发现酵母的无细胞抽提液也能将糖发酵成乙醇。巴克纳（Buchner）兄弟发现酵母的无细胞抽提液也能将糖发酵成乙醇，从而阐明了发酵是酶的作用的化学本质。他们的成功为20世纪酶学和酶工程学的发展揭开了序幕。因此巴克纳获得了1907年诺贝尔化学奖。★锁钥学说：1894年，德国化学家EmilFisher提出了酶与底物分子作用的锁钥学说。这个理论强调只有固定的底物才能楔入与它互补的酶表面，它较好地解释了酶的立体结构的专一性，但却不能解释酶的专一性中的所有现象。★中间络合物学说：1903年，Henri在研究蔗糖酶水解蔗糖的反应中发现酶与底物之间存在某种关系，并提出酶与底物的作用是通过酶与底物生成络合物而进行的。●1913年Michaelis和Menten根据中间络合物学说，导出了著名的Michaelis-Menten方程，简称米氏方程：V＝V[S]/(Km＋[S])。★诱导契合学说：1958年Koshland提出了诱导契合学说。Koshland认为：酶分子的活性部位结构原来并不与底物分子的结构互补。但活性部位有一定的柔性，当底物分子与酶分子相遇时可以诱导酶蛋白的构象发生相应的变化，使活性部位上各个结合基团与催化基团达到对底物结构正确的空间排布与定向从而使酶与底物互补结合，产生酶—底物复合物，并使底物发生化学反应。★酶的化学本质的认识：1926年，Sumner提出酶的本质是蛋白质。萨母纳（Sumner）首次从刀豆提取液中分离得到脲酶结晶，证明它具有蛋白质的性质，提出酶的本质是蛋白质的观点。1960年，雅各（Jacob）和莫若德（Monod）提出操纵子学说，阐明了酶生物合成的基本调节机制。●1982年，切克（Cech）等人认为RNA亦具有催化活性，并将这种具有催化活性的RNA称为核酸类酶。切克（Cech）等人发现四膜虫（Tetrahynena）细胞的26sRNA前体具有自我剪接功能(self-splicing)，他们认为RNA亦具有催化活性，并将这种具有催化活性的RNA称为核酸类酶。该RNA前体约有6400个核苷酸，含有1个内含子（intron）或称为间隔序列（interveningsequence,IVS）和2个外显子(exon)，在成熟过程中，通过自我催化作用，将间隔序列切除，并使2个外显子连接成成熟的RNA，此过程不需要蛋白质存在，但必须有鸟苷和镁离子参与。切克将之称为自我剪接反应，认为RNA亦具有催化活性，并将这种具有催化活性的RNA称为核酸类酶。●核酶（Ribozyme，也称核糖核酸酶）的发现，打破了酶是蛋白质的经典概念。核糖核酸RNA也具有催化活性。●核酶具有完整的空间结构和活性中心，有独特的催化机制，具有很高的底物专一性，其反应动力学亦符合米氏方程的规律。●酶是由生物细胞合成的以蛋白质为主要成分，对底物起高效催化作用的生物催化剂。●按照酶的化学组成，分为两大类。一类主要由蛋白质组成，称为蛋白类酶（P酶）；另一类主要由核糖核酸组成，称为核酸类酶（R酶）。（三）酶工程学习的目的◆初步掌握酶的发酵生产和分离纯化的大致流程。◆对酶的固定化、酶的修饰改造和主要的酶反应器类型有一定的认识。◆了解生物传感器及酶对现代人类生活的影响。（四）酶工程的发展概况（1）生物工程概念：1983年，在英国伦敦召开的世界首次生物工程学会议时，对生物工程下了一个简明的定义。生物工程是达到特殊目的的生物过程的控制性过程，它是将生物体内进行的精巧的生物化学反应工业化，在人们控制下制造出有用产品的技术体系。（2）生物工程的四大支柱：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程。（3）酶工程（enzymeengineering）概念：酶工程是研究酶的生产和应用的一门技术性学科，主要指自然酶制剂在工业上的大规模应用，是生物工程的重要组成部分。酶工程研究的主要内容包括：（1）酶的生物合成法生产；（2）酶的分离纯化；（3）酶的分子修饰；（4）酶、细胞及原生质体的固定化；（5）酶的反应动力学；（6）酶反应器；（7）有机介质中的酶催化；（8）酶的应用等。（4）酶工程发展现状：尽管目前业已发现和鉴定的酶约有8000多种，但大规模生产和应用的商品酶只有数十种。自然酶在工业应用上受到限制的原因主要有：①大多数酶脱离其生理环境后极不稳定，而酶在生产和应用过程中的条件往往与其生理环境相去甚远；②酶的分离纯化工艺复杂；③酶制剂成本较高。（5）酶工程的分类：根据研究和解决上述问题的手段不同把酶工程分为化学酶工程和生物酶工程。前者指自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用，后者则是酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。①化学酶工程(初级酶工程)：是酶学和化学工程的结合；化学修饰；固定化酶；化学合成酶。②生物酶工程：利用DNA重组技术(基因工程)大量生产酶；对基因进行修饰，产生突变酶；设计新的基因，合成自然界没有的、催化效率和稳定性高的酶。1980年，Wagner等人报道，将大肠杆菌ACTT11105的青霉素酰化酶基因克隆到质粒上，获得产酶活力更高的大肠杆菌5K（PHM12）杂交株，并将此大肠杆菌杂交株固定，用于生产青霉素酰化酶。这是基因工程与酶工程相结合的第一例。总而言之，酶工程的主要任务是：通过预先设计，经过人工操作控制而获得大量所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其最大的催化功能。第二节酶催化作用的特点与机制（一）一般催化剂的特点●催化效率高●反应前后质量不变●催化热力学允许的反应●加速可逆反应的进程，不改变反应的平衡点（二）酶促反应的特点●酶的高度催化效率（本质）●酶的催化具有高度特异性●酶促反应的条件温和●酶的催化受调控●酶的高度催化效率：酶与一般催化剂催化效率的比较●酶的高度专一性：在一定条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。1）绝对专一性(Absolutespecificity)：作用于一种底物进行专一反应生成一种特定产物。如脲酶只催化尿素分解。2）相对专一性(RelativeSpecificity)：一种酶能够催化一类结构相似或一种化学键的化合物进行某种相同类型的反应。现已证实，大部分酶表现出相对专一性。相对专一性又分为键专一性（只作用一定的键而对键两侧的基团无严格要求，如酯酶催化水解酯键）和基团专一性（除了要求一定的化学键外，对键两侧基团也有不同程度的要求，如，胰蛋白酶水解碱性氨基酸的羧基形成的肽键、酯键、酰胺键；胰凝乳蛋白酶则要求被水解的键有芳香氨基酸的羧基参与）。如脂肪酶、磷酸酯酶和蛋白水解酶等。以蛋白酶为例◆胰凝乳蛋白酶：口袋较大，主要由疏水氨基酸残基围成，开口较大（由两个Gly组成），因此需要底物有一个疏水基团（芳香环Phe、Tyr、Trp及大的非极性侧链）定位。裂解芳香族氨基酸羧基侧的肽键。◆胰蛋白酶：口袋较大，底部有Asp，利于Lys、Arg结合，裂解碱性氨基酸残基羧基侧的肽键。胰蛋白酶选择性地水解含有赖氨酸-或精氨酸的肽键，所以，凡是含有赖氨酸-或精氨酸的肽键的物质，不管是酰胺、酯或多肽、蛋白质都能被胰蛋白酶水解。◆弹性蛋白酶：口袋较浅，开口较小（由Val，Thr组成）只能让Ala等小分进入，裂解小的中性氨基酸残基羧基侧的肽键。各种蛋白酶虽然都能水解肽键，表现为基团专一性，但彼此又有所不同。3）立体异构专一性：当酶作用的底物或形成的产物含有不对称碳原子时，酶只能作用于异构体的一种，这种绝对专一性称为立体异构专一性。如：L-乳酸脱氢酶：作用于L-乳酸；延胡索酸酶：作用于反式丁烯二酸。4）酶作用专一性的机制◆锁钥学说：认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。◆诱导契合学说：认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状。●酶的催化受调控（1）代谢物对酶活性的抑制和激活；（2）酶活性的调节：共价修饰、酶原激活；（3）酶含量的调节：诱导、阻遏和降解。●酶催化作用的条件温和（1）酶促反应一般在pH5~8水溶液中进行，反应温度范围为。（2）高温或其它苛刻的物理或化学条件，将引起酶的失活。第三节酶的作用机制酶的活性部位(activesite)或活性中心(activecenter)酶的必需基团(essentialgroup)：结合基团(bindinggroup)和催化基团(catalyticgroup)。酶的催化作用可能来自5个方面:●广义的酸碱催化●共价催化●邻近效应及定向效应●变形或张力●酶的活性中心为疏水区域一、广义的酸碱催化(Generalacid-basecatalysis)