液体活检

液体活检在肿瘤精准治疗中的研究进展郑秋红福建省肿瘤医院，福建省肿瘤研究所福建省肿瘤生物治疗重点实验室2016.4.21内容摘要一.液体活检1）cfDNA&ctDNA&CTC概念和最新研究进展二.CTC/CTSC研究方法和进展2）液体活检应用和意义三.我们的研究液态活检•来源于肿瘤组织，存在于血液中：•循环肿瘤细胞（CTC）•循环肿瘤DNA（ctDNA）•肿瘤外泌体exosome•提示肿瘤发展进程及抗药性等信息，指导个体化精准治疗DiazLAJr,BardelliA.LiquidBiopsies:GenotypingCirculatingTumorDNA.JClinOncol.2014;32(6):579–586cfDNA•What:循环游离DNA，机体细胞释放入外周血循环后发生部分降解的内源性DNA。高度片段化，约170bp。•Source:正常细胞、异常细胞（如肿瘤细胞），病毒DNA等•State:半衰期短，动态表达量，核小体以单个、双联或三联的形式进入血液，并逐步分解。cfDNA（cell-freeDNA）ctDNA•What:循环肿瘤DNA，是指肿瘤细胞DNA经脱落或细胞凋亡后释放进入循环系统。一种特征性的肿瘤生物标记物，可以被定性、定量和追踪。•Source:来源于肿瘤细胞的cfDNA，属于cfDNA的一种类型。不同患者的水平差异显著，受肿瘤负荷，分期等因素的影响ctDNA（circulatingtumorDNA）cfDNA&ctDNAEllenHeitzer,PeterUlz,andJochenB.Geig.CirculatingTumorDNAasaLiquidBiopsyforCancer.ClinicalChemistry.2015,112–1231：CAPP-Seq（cancerpersonalizedprofilingbydeepsequencing）癌症个体化深度测序分析方法:利用定制化的NimbleGenSeqCapEZChoiceLibrary作为”筛选器“对样本靶向捕获后再深度测序，灵敏度高，特异性强且经济可行。2：利用数字错误抑制（IDES）的方法和CAPP-seq（ctDNA测序方法），能够检测到频率低至0.004％的突变等位基因NewmanAM,LovejoyAF,KlassDM,etal.IntegrateddigitalerrorsuppressionforimproveddetectionofcirculatingtumorDNA.NatureBiotechnology(2016)doi:10.1038/nbt.3520ctDNA-高通量测序cfDNA－片段谱系分析Deepsequencingofcirculatingcell-freeDNAyieldsadense,genome-widemapofnucleosomeoccupancythatenablesidentificationofitscell-typesoforigin,potentiallyenablingthenoninvasivemonitoringofabroadersetofclinicalconditionsMatthewW.Snyder,MartinKircher,AndrewJ.Hilletal.Cell-freeDNAComprisesanInVivoNucleosomeFootprintthatInformsItsTissues-Of-Origin.Cell.2016Jan14;164(1-2):57-68.CTCWhat：循环肿瘤细胞，是指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。Source:原发肿瘤和转移灶都会释放CTC。可检测到的CTC是肿瘤细胞在循环系统微环境下生存竞争的结果。CTC（circulatingtumorcells）液体活检应用价值（监测肿瘤特异性突变发现肿瘤复发）EllenHeitzer,PeterUlz,andJochenB.Geig.CirculatingTumorDNAasaLiquidBiopsyforCancer.ClinicalChemistry.2015,112–123液体活检应用价值（分析耐药株的遗传变异）EllenHeitzer,PeterUlz,andJochenB.Geig.CirculatingTumorDNAasaLiquidBiopsyforCancer.ClinicalChemistry.2015,112–123液体活检优势及前景•液态活检无侵入性、可频繁多次检测及快速反应能力均体现出发展潜力巨大应用价值。将削减无效肿瘤医疗开支、降低医疗成本。•适应症广泛，如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、食管癌等常见肿瘤均可用液态活检技术进行诊断与监测。•2015年美国发布的肿瘤治疗计划的四大举措之一：“液态活检”血浆开发新方法来评估治疗反应以及抵抗可能的耐药性。•根据中国国家癌症中心发布的数据，我国5年内诊断为癌症且仍存活的病例数约为749万。也是液态活检巨大的市场。CTC研究概况1）CTC与转移的关系2）CTC异质性与肿瘤治疗3）CTC应用和意义4）CTC研究方法CTCs(circulatingtumorcells,CTCs)Ashworth早在1896年就提出了循环肿瘤细胞的概念。侵入循环系统的肿瘤细胞，大部分由于机体的免疫识别、机械杀伤及自身凋亡在短期内死亡，只有极少数存活下来，在适于自身存活和增殖的器官或组织形成转移灶。CTC与肿瘤转移SimonAJoosse,TobiasMGorges,andKlausPantel.Biology,detection,andclinicalimplicationsofcirculatingtumorcells.EMBOMolMed.2015;7(1):1–11.BrouwerA,DeLaereB,PeetersD,etal.consequencesofheterogeneityinthecirculatingtumorcellcompartment.Oncotarget.2016Mar9.doi:10.18632/oncotarget.8015.CTC异质性CTC应用和意义CTCs肿瘤转移预测肿瘤治疗CTCs数量改变反映了肿瘤细胞对各种治疗方案的敏感性和有效性，为个体化治疗提供依据。监测早期转移乳腺癌、前列腺癌结肠癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌多种肿瘤监测CTCs基因表达／突变，找到药物敏感的靶点，指导个体化治疗CTC优化治疗方案2014年GoldKorn，接受多西他赛联合阿曲生坦治疗的转移性去势抵抗性前列腺癌患者，基线循环肿瘤细胞CTC数量可预测预后，3周时CTC升高提示总生存较差，有望作为重新指导和优化治疗的较好指标。GoldkornA，ElyB，QuinnDI，etal．CirculatingTumocellcountsarePrognosticofoverallsurvivalinSWOGS0421：aPhaseIIITrialofdocetaxelwithorwithoutatrasentanForMetastaticcastrationresistantprostatecancer.JClinOncol201432(11)：1136-1142．2012年Bian,乳癌患者在接受化疗（白蛋白结合型紫杉醇+卡培他滨+曲妥珠单抗）前后CTC变化。治疗前：CTC3，HER-2+；1疗程：CTC0。6疗程：病理学CR。证实CTC值在乳腺癌治疗早期发生显著变化，能够准确预示疗效，能够科学指导选择治疗方案。BianL，WangT，LiuY，etal．Evaluationoftreatmentresponseforbreastcancer：areweEnteringtheeraof”biologicalCompleteremission”?．ChinJCancerRes．2012，24：403-407．CTCs的研究方法RamdaneHarouaka,ZhigangKang,Si-YangZheng,LiangCao.Circulatingtumorcells:Advancesinisolationandanalysis,andchallengesforclinicalapplications.Pharmacology&Therapeutics.2014;141:209–221.研究方法（1）-CellSearchCellSearch系统是唯一经FDA批准进入临床应用的CTCs检测方案。原理：EpCAM抗体标识的微磁珠从全血中捕获细胞，用免疫荧光识EpCAM+CK+CD45−进行磁性分离。CTCEpCAMCKCD45DAPICellSearch数据解读:1.7.5ML外周血2.判断阈值：转移性乳腺癌CTCs≥5细胞前列腺癌CTCs≥5细胞结肠癌：CTCs≥3细胞表明预后不良3.目前FDA只批准用于以上三种肿瘤CTCs的研究方法（2）-基因芯片CTCs的研究方法（3）-测序XiaohuiNia,MingleiZhuo,ZheSua，etal.Reproduciblecopynumbervariationpatternsamongsinglecirculatingtumorcellsoflungcancerpatients.PNA,2013,52(110)21083-21088.XiaohuiNia,MingleiZhuo,ZheSua，etal.Reproduciblecopynumbervariationpatternsamongsinglecirculatingtumorcellsoflungcancerpatients.PNA,2013,52(110)21083-21088.RamdaneHarouaka,ZhigangKang,Si-YangZheng,LiangCao.Circulatingtumorcells:Advancesinisolationandanalysis,andchallengesforclinicalapplications.Pharmacology&Therapeutics.2014;141:209–221.CTCs的分离方法（1）CTCs的分离方法（2）-体外培养MinYu,AdityaBardia,NicolaAceto,etal.Exvivocultureofcirculatingbreasttumorcellsforindividualizedtestingofdrugsusceptibility.Science.2014;345(6193):216–220.PapanicolaoustainingforunculturedprimaryRepresentativeimagesofnonadherentCTCimmunofluorescentstaining：CK：red；Ki67：yellow；CD45：green；DAPI：blue.CTSC研究概况1）CTSC定义2）CSC,CTC,CTSC三者关系3）CTSC研究进展4）CTSC研究难点和未来方向CTSC背景介绍循环肿瘤干细胞（circulatingtumorstemcells,CTSCs）：CTCs中具有干细胞特性，即自我更新及分化潜能的一小群细胞。作为标志物CTSC具有更重要的临床价值。EMT可使CTCs获得干细胞特性，而具有药物耐受性和高侵袭性。CTSC已在包括肝癌，乳腺癌，胃癌，结直肠癌等多种肿瘤中被证实。CSC,CTC,CTSC（肿瘤转移等级结构图）YangMH,ImraliA,HeeschenC.Circulatingcancerstemcells:theimportancetoselect.ChinJCancerRes.2015Oct;27(5):437-49.MarkersforCTSCYangMH,ImraliA,HeeschenC.Circulatingcancerstemcells:thei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