细胞实验方法原理

一、细胞培养：1.细胞培养：从活的机体中取出组织或细胞，分散成单个细胞，模拟机体内的生长条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使其在体外环境中继续生长繁殖的过程，并维持其结构和功能的技术。2.细胞培养的基本条件：无菌条件、细胞生长条件、细胞检测条件、细胞保存条件。3.无菌条件：1）净化工作室：净化工作间是基于无菌条件下进行细胞培养操作的场所，设计标准为万级，专供细胞培养、冻存以及细胞治疗用。①细胞培养间：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。每周乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒②洁净层流罩：层流罩是可提供局部高洁净环境的空气净化的设备。主要由箱体、风机、初效空气过滤器、中效空气过滤器、高效空气过滤器、阻尼层、灯具等组成。③传递窗：该装置是一种洁净室的辅助设备，主要用于洁净区与非洁净区之间小件物品的传递，以减少洁净室的开门次数，把对洁净区的污染降低到最低程度。④无尘服层流净化细胞培养室的总体要求：经济、有序、高效、安全。相关制度：I.准入制度：没有经过培训的人员不得单独进入净化室工作。进入净化室后要保持安静，不得大声喧哗。II.安全制度：谨慎使用酒精灯，实验人员自觉维护室内设备的安全使用，对室内的仪器如CO2孵箱等要经常注意机器运转情况，发现问题及时检修或报告请人检修。离开时断开必要的仪器电源。III.卫生消毒制度：一般情况下细胞间每天消毒一次，方法为紫外线消毒（每次30分钟至1小时）一次，另外每周用10％乳酸在紧闭门窗下熏蒸30分钟；实验完毕应及时清理所用物品，注意台面整洁；层流净化室实施值日生负责制。IV.出入制度：总体原则为进出净化室应按次序开、关门，只有将前面打开的门关闭后才允许打开下一个门，使缓冲间起到应有的作用。所有进出层流净化细胞培养室的物品均应通过传递窗进行，紫外灯照射15分钟2）无菌操作的仪器设备：①超净工作台：工作原理是利用鼓风机驱动空气经过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。使用前开启柜内紫外灯照射10－30分钟，预工作10－15分钟，以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态。使用完毕后，要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。②生物安全柜：既能使操作造成无菌、无尘的局部空气环境，保证检验、检测不受污染，又能保证被研究的对象（如病菌、细菌等）不外溢，保护周围环境及操作人员安全。广泛应用于低、中等危险度（病原体1--3，DNA重组P1--P3）的临床细菌学，病毒学、微生物学、组织培养、生物学及生命科学的研究，加工、检验部门。③高压灭菌锅：121℃，20min，适用于耐高温耐高压，不怕潮湿的物品（器械、细菌培养基等）④电热干燥箱：干热消毒，主要用于玻璃器皿消毒。⑤紫外线：主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒。⑥过滤除菌设备：0.45um和0.22um滤膜，大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。4.培养细胞的生长条件：营养需要、生存环境（37℃、5%CO2、pH7.2-7.4）、无污染、无毒①玻璃器皿的清洗：浸泡、刷洗、浸酸和清洗四个步骤浸泡（自来水）→刷洗（洗衣粉）→泡酸（24小时）→流水冲洗→蒸溜水浸泡和冲洗→60-80℃烘干②CO2培养箱：37℃，5%CO2，用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气；保持培养箱内空气干净，定期消毒（90℃，14h)；箱内蒸馏水槽中保持足够的灭菌蒸馏水以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。③水：一级水：基本上不含有溶解或胶态离子杂质及有机物。二级水经过石英设备蒸馏或离子交换混合床处理后，再经0.2um微孔滤膜过滤来制取。一级水用于有严格要求的分析试验，包括对颗粒有要求的试验，如高压液相色谱用水。二级水：可含有微量的无机、有机或胶态杂质。可用多次蒸馏或离子交换等方法制取。二级水用于无机痕分析等试验量分析等试验，如原子吸收光谱分析用水。三级水：适用一般实验室实验工作。可以用蒸馏、离子交换等方法制取。④平衡盐溶液：主要由无机盐和葡萄糖配制而成作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度，提供细胞生存所需的无机离子，主要作为合成培养基的基础溶液以及用于洗涤细胞组织等。常用：生理盐水（0.9%），PBS，Hanks液Hanks液是生物医学实验中最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液，主要用于配制配制培养液、稀释剂和细胞清洗液，而不能单独作为细胞、组织培养液。⑤pH调节液：碳酸氢钠HEPES：一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂，通常使用浓度为10～15mM。⑥消化液：胰蛋白酶溶液：主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来，常用浓度为0.25%或0.5%胰蛋白酶，不含Ca2+\Mg2+\血清的平衡盐溶液配制，pH8左右，滤器过滤除菌。EDTA溶液：作用机制是破坏细胞间的连接。对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰酶的混合液，EDTA溶液的使用浓度为0.02%，Hanks液溶解后高压灭菌，配制时应加碱助溶（EDTA不能被血清中和）。胶原酶溶液：胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用，胶原酶作用的对象是胶原组织，因此不容易对细胞产生损伤，不受Ca2+\Mg2+\血清抑制，可采用磷酸缓冲液配制。⑦抗生素溶液：通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。⑧培养基：是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限；成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染。合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。RPMI-1640适用于悬浮细胞培养，主要针对淋巴细胞。DMEM（H）高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等⑨血清：人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖还需补充一定量的天然培养基（如血清）。血清中含有：多种蛋白质、多种金属离子、激素、促贴附生长物质、各种生长因子、转移蛋白、不明成分。质量鉴定：a.理化性质：如如渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等。蛋白含量包括血清总蛋白含量（不低于35-45g/L）、球蛋白含量（应小于20g/L)、血红蛋白含量等。其中球蛋白含量是一项非常重要的指标，血清中球蛋白主要是抗体，球蛋白含量越低血清质量越高。血红蛋白也是越低越好。b.微生物检测：包括细菌、真菌、支原体、病毒等。特别是对支原体、病毒的检测，支原体是一种很小的微生物，可通过孔径22um的滤膜。支原体、病毒污染在光学显微镜下难于察觉，细胞也能生长繁殖，但会影响实验结果。检测支原体的方法很多，如培养法、PCR法、荧光染色法、电镜观察法等。常用血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，胎牛血清品质最高。优质血清的标准：透明、淡黄色、无沉淀物、无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）56℃30分钟血清的消毒：过滤除菌逐步解冻法：–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装40～45ml。勿直接由–20℃至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。⑩谷氨酰胺：细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50%，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。完全培养基的组成：基础培养基、血清、青/链霉素(各100单位/mL)、碳酸氢钠(2g/L)、谷氨酰胺、生长因子。每次配液量以两周左右为宜，一次配液不要太多，防止营养成分（主要为谷氨酰胺）损失，2-8℃保存无血清培养基：由基础培养基和替代血清的补充成分组成。5.细胞检测条件：倒置显微镜、酶标仪、微孔板震荡器、高速离心机、移液器6.细胞保存条件：液氮罐、冻存管二、细胞培养的基本技术1.无菌操作技术antiseptictechnique：工作环境及表面的处理、细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理、培养液的处理、实验者的操作技术。1）常用细胞培养相关物品的灭菌方法：•培养液等易失活物质：过滤；抗生素•平衡盐溶液及其它需要灭菌的液体：121℃,20分钟；过滤•布类、玻璃制品、金属器械、细胞培养耗材等：121℃,20分钟，然后烘干；•玻璃瓶：干热灭菌170℃,4小时。•操作台面：紫外线；70%酒精涂擦•实验者：70%酒精涂擦2）•无菌培养室每天紫外线照射消毒30-50min每周用10％乳酸在紧闭门窗下熏蒸30分钟。•超净工作台台面每次实验前要用70％酒精擦洗，然后紫外线消毒10-30min。•在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线•应尽量避免瓶口在超净台中敞开直立•同一根吸管或滴管不应连续用于几个不同的细胞系2.培养细胞的观察：1）肉眼观察培养物颜色及浑浊度2）倒置显微镜观察细胞生长状态3.体外细胞培养分型：1）贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，仅大致分成以下四型：成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多型细胞型。2）悬浮型：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源：自血、脾或骨髓，尤以血中白细胞癌细胞特点：在悬浮中生长良好细胞圆形、单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)3）培养细胞的“一代生存期”：从细胞接种后到再次传代培养之前的这一段时间。a.潜伏期(latentphase)b.对数生长期(logarithmicgrowthphase)c.停滞期(stagnatephase)4.细胞传代：体外生长的培养细胞受营养条件、生长空间等因素的限制，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液进行扩大培养一部分细胞和更新营养液进行扩大培养，此过程称传代（subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。根据细胞生长的特点，传代方法有3种：1)悬浮生长细胞传代：离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液混匀后再传代。2)半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）：此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3)贴壁生长细胞传代：采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。5.细胞计数：培养的细胞在般条件下要求有定的密度才能生长良好一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每mL细胞数表示。血细胞计数板：手工计数细胞。细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×稀释倍数×104镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液；最适浓度为5～10×105细胞/ml，此范围外计数误差偏大。血球计数仪：自动计数6.细胞活力的测定：总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。活细胞率=（细胞总数-死细胞数）/细胞总数×100%台盼蓝法：活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。7.细胞冻存和复苏：细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。其原则是慢冻快融。1）常用的低温保护剂是DMSO（终浓度5-20%），它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜