RNA-pull-down

RNApulldown实验技术流程①目标RNA生物素标记②磁珠富集RNA③RNA结合蛋白孵育④RNA结合蛋白洗脱⑤WB或者MS检测RNApull-down实验常见问题一.质粒转化、涂板、摇菌1.取JM109感受态细菌80µl，加入1.5mlEP管中，用10µl枪头沾取质粒加入上述EP管中，混匀。2.冰上静置30min。3.42℃热休克90-120s。4.迅速移至冰上静置2min。5.在超净台内，于上述EP管中加入50µllb培养基(Amp-)，37℃，160rpm摇床，增菌0.5-1h。6.菌液4,000rpm离心10min，弃大部分上清，将沉淀重悬，菌液全部加入LB平板(Amp+)上，涂布均匀，37℃倒置培养(过夜12-15h)。7.将37℃培养(12-16h)平板取出，于无菌操作台中挑取单克隆放入内含5mlLB培养基(Amp+)的15ml离心管中，于37℃、250rpm摇床增菌过夜18H,看菌液是否浑浊。菌液浑浊后进行质粒中提。二.质粒中提(TIANgen，DP107-02)1.柱平衡：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500µl的平衡液BL，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。2.取1.5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清。3.向留有菌体沉淀的离心管中加入250µl溶液P1使用移液器彻底细菌沉淀。4.向离心管中加入250µl溶液P2，温和的上下翻转6-8次使菌体充分裂解。5.向离心管中加入350µl溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀，12,000rpm，离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。6.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，12,000rpm，离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。7.向吸附柱CP3中加入500µl去蛋白液PD，12,000rpm离心，离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。8.向吸附柱CP3中加入600µl去蛋白液PW，12,000rpm离心，离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中。重复一次。9.将吸附柱CP3重新放回收集管中，12000rpm离心2min。10.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50µl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，放冰盒，测浓度。三.质粒线性化：本实验使用的酶为Biolabs的重组酶KpnⅠ。酶切后进行跑胶。四.琼脂糖凝胶电泳1.配胶。成分：琼脂糖粉、TBE、ⅠH2O，少量EB。2.TBE与H2O混合加入放好琼脂糖粉的锥形瓶中，摇匀，放入微波炉加热1-2min。3.滴加少量EB，于锥形瓶中摇匀。4.倒入胶板中，插入梳子，待琼脂糖凝固。5.小心拔掉梳子，取10µl样品加入1µl的10×LoadingBuffer缓缓加入点样孔，并在最右边的点样孔加5µlDNAmaker。6.接通电源。7.电泳完毕，关闭电源。从胶模中取出琼脂糖凝胶，于紫外灯下切下目的条带。五.胶回收(TIANGEN，DP214-02)1.向吸附柱CB2中加入500µl平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2.将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。3.向胶块中加入等倍体积溶液PC，50℃水浴放置10min左右，其间不断的上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。4.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。5.向吸附柱CB2中加入600µl漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。6.重复操作步骤⑤。7.将吸附柱CB2放入收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。8.将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12,000rpm离心2min，收集DNA溶液。六.转录以及生物素标记：1.取无RNA酶管，按下表操作：1µg线性化DNAxµlBiotinRNALabelingmix2µl10×Transcriptionbuffer2µlRNAPolymerase2µl补足RNase-free水至18µl2.取出孵育好的EP管，加入2µl的DNaseⅠ，37℃孵育15min以除去体系中的DNA。3.取出上述操作的EP管，加入2µl0.2MEDTA(pH=8.0)终止反应。4.取1µgBiotin标记的RNA，加入适量StructureBuffer,使得RNA形成二级结构。然后将RNA95℃加热2min，冰浴3min，室温静置30min。5.磁珠准备：使用RIPWashBuffer500µl冲洗磁珠3次。6.用50µlRIPWashBuffer重悬磁珠，然后将其加入到生物素标记并变性的RNA中，4℃过夜。7.过夜的混合物3000rpm离心1min，去上清。8.RIPWashBuffer冲洗3次，切记将液体沿壁加入或者滴加，上下缓慢翻转混匀，切勿用移液器吹打。9.往磁珠-RNA混合物中加入细胞裂解液，裂解液中加入适量RNase抑制剂，室温放置1h。10.将孵育好的磁珠-RNA-蛋白混合物低速离心，上清回收，使用RIPWashBuffer冲洗3次，1次1ml。11.于样品中加5×SDS上样缓冲液，95℃变性10min，跑SDS-PAGE凝胶。12.考染：取出SDS-PAGE凝胶于考马斯亮蓝染色液中，摇床过夜。次日用考马斯亮蓝脱色液脱色1~2h，中间更换几次脱色液至条带清晰，背景低为止。13.将目的条带切下送测序(质谱检测)。对于一幅RNApull-down实验结果Figure，应包含位点作用示意图、WB或质谱结果数据分析图，并应在Supplement中补充相关的验证性实验图片，具体如下图所示。RNA序列：G表示空间构象的变化，AS表示互补链的的二级结构，S表示正义链的二级结构。FigureA：用不同的A、AS、GRNA序列去PullingDown蛋白符合物，并用不同的KCL浓度梯度洗脱。蛋白抗体NCLhnRNPUhnRNPFRPL7hnRNPK的单抗进行WB实验。检测AASG特定区段的结合的蛋白复合物的组分。FigureB：RNAPulldown后的将蛋白复合物进行质谱实验，发现结合蛋白NCL的肽段。不同RNA构象A、AS、G结合的肽段的不同。FigureC：通过重组NCL到GST上，通过GSTPulldown捕获符合物，进行qRT-PCR检测RNA片段AS、S、G和细胞组成型表达RNA（UnboundRNAGAPDH）。FigureD：RNAPulldown结果进行SDSPAGE电泳检测。上面四泳道分别为不同的RNA捕获方式，UTP生物素化，无生物素化等。Supplement：ARNAmotif（结构域）注释和motif生物素化结合链霉亲和素。B在不同的处理条件下（ATPdepletion）下进行RNApullingdown后用Cup和Smaug蛋白单抗进行WB检测。CRNAPulldown的RNA探针，在加上Cap帽子结构和不加帽子的情况下捕获的蛋白用elF4G翻译延伸因子CuP蛋白进行WB。有帽子结构的才能有翻译效应。