RNA-pull-down—研究RNA与蛋白互作的法宝

RNApulldown——研究RNA与蛋白互作的法宝RNA与蛋白质的相互作用是细胞生理过程得以实现的决定性因素之一。近年来，随着技术的改进和新方法的建立，RNA和蛋白质的相互作用研究取得了长足进步。目前科研人员已经鉴定了较多RNA上的蛋白质结合位点，也发现了许多蛋白质中的RNA结合结构域，并对它们的结构特征进行了比较详细的研究。这些为最终探明RNA和蛋白质相互作用的分子机制，从而从本质上认识相关的细胞生理过程打下了坚实的基础。RNApull-down作为研究RNA与蛋白互作的核心技术，已成为研究焦点。RNApulldown是使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过WB实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用，或者结合MS筛选RNA结合的未知蛋白。RNApulldown技术应用1.癌症肿瘤相关调控机制研究LncRNA发挥功能的方式很广，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控。主要包括基因组表观遗传修饰、调控转录后翻译、发挥ceRNA、增强子RNA作用等，从而对细胞的增殖、分化、迁移、凋亡、免疫等发挥调控作用。lncRNA能够通过对肿瘤细胞糖代谢、谷氨酰胺代谢和脂类代谢途径中的关键环节进行调节，导致肿瘤细胞对葡萄糖摄取增加、谷氨酰胺分解增强及脂质生成增加，从而促进肿瘤的发生和发展。目前，大多数lncRNA在肿瘤细胞能量代谢中的功能和调控机制尚不完全清楚，进一步认识和了解肿瘤细胞中与lncRNA相关的能量代谢异常表现出的恶性生物学行为，将有助于为肿瘤的诊断和治疗提供有效的证据及新的思路和途径。环状RNA（circularRNA，circRNA）是近来研究很热门的一种特殊的长链非编码RNA。研究发现，circRNA在人体细胞中广泛表达，在转录后水平具有调控基因表达的重要功能，并且参与多种肿瘤和其他疾病的病理发展过程circRNA大多由外显子序列组成，呈闭合环状结构，性质稳定，高度保守性，通过微小RNA“海绵”作用调控靶基因表达，与肿瘤的发生、发展相关。这些特性使circRNA有潜力成为肿瘤新型分子诊断标志物。通过竞争性与肿瘤相关微小RNA的结合，可以开发针对circRNA分子靶点的靶向治疗药。因此,circRNA在肿瘤转化医学研究中意义巨大。2.多种人类疾病研究RBPs在转录后水平参与调控mRNA稳定性、LncRNA活性、应激、肿瘤发生发展、细胞凋亡等众多生物学过程，且与诸多人类疾病密切相关。因此，对RBPs-RNAs相互作用网络的研究和鉴定有重要意义。但由于RBPs作用方式复杂、功能多样性、作用空间位置多样化等原因，对其开展精确研究一直是一个重大挑战。RNA领域，尤其是非编码RNA研究的快速发展，催生了多种RBPs-RNAs相互作用鉴定技术。RNApull-down实验常见问题问题原因解决方案RNA结合蛋白的亲和力不够1）结合缓冲环境没有优化2）裂解不完全3）磁珠用量不足4）RNA探针用量不足1）优化孵育时间、温度、盐浓度等条件2）增加裂解液和蛋白上样量的比例3）增加裂解液4）增加磁珠或探针用量5）确定生物素和链霉亲和素效率RNA结合蛋白没有结合1）靶蛋白量不足2）缓冲体系不对3）RNA探针和蛋白的亲和力本来就低1）增加上样蛋白量2）应用低盐体系3）加入交联试剂WB信噪比高1）阳性信号率低2）一抗效率低3）蛋白没有充分溶解1）增加二抗的量2）用敏感度的化学发光液3）用细胞裂解液预孵一抗4）增加样品的量5）确定有没有其他可能的结合情况6）增加裂解液用量结合的非特异性高1）缓冲环境没有优化2）缓冲环境严谨性低3）样品没有裂解完全和裂解体系没有优化1）优化孵育时间温度盐浓度等条件2）使用严谨性高的缓冲体系3）调低RNA探针和样品的比例4）提高裂解液的量案例展示案例一题目：TheSTAT3-BindingLongNoncodingRNAlnc-DCControlsHumanDendriticCellDifferentiation小结：RNApull-down设置实验组及反义链对照组，银染找出差异条带进行胶条质谱鉴定，分析结果筛选得到STAT3蛋白，进一步通过RIP-qPCR反向验证，证实STAT3蛋白可以与lnc-DC结合。Lnc-DCpull-down银染检测及RIP验证Lnc-DC与STAT3互作案例二题目：ThelongnoncodingRNATHRILregulatesTNFαexpressionthroughitsinteractionwithhnRNPL小结：先用Linc1992全长进行RNApull-down实验，通过WB检测手段分析四个意向蛋白中筛选得到一个差异蛋白α-hnRNPL，通过分段RNApull-down及WB分析核心结合区域，主要是Linc1992的1-699和1406-2012区域，通过RIP-qPCR反向验证，证明α-hnRNPL蛋白可以与Linc1992结合。Linc1992pulldown-WB筛选差异蛋白同时结合RIP验证Linc1992与α-hnRNPL互作