大黄中蒽醌类成分的提取

大黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴别一、实验目的1.掌握蒽醌苷元的提取方法——酸水解法。2.掌握缓冲纸色谱的原理及基本操作技术。3.掌握pH梯度萃取法的原理及操作技术。4.通过大黄酚和大黄素甲醚的分离实验，熟悉柱色谱的操作技术。5.熟悉蒽醌类化合物的鉴定方法。二、基本原理大黄中羟基葸醌类化合物多数以苷的形式存在，故先用稀硫酸溶液把蒽醌苷水解成苷元，利用游离葸醌可溶于热氯仿的性质，用氯仿将它们提取出来。由于各羟基葸醌结构上的不同所表现的酸性不同，用pH梯度萃取法分离它们；大黄酚和大黄素甲醚酸性相近，利用其极性的差别，用柱色谱分离之。三、操作要点1.提取、分离流程（如图一）2.总蒽醌苷元的提取大黄粗粉100g，加20％硫酸溶液300ml润湿，再加氯仿500ml，回流提取2hr，稍冷后过滤，残渣弃去，氯仿提取液于分液漏斗中，分出酸水层，得氯仿提取液。图1.大黄提取分离流程图3.蒽醌苷元的分离和精制（1）蒽醌类成分的缓冲纸色谱试验为了验证分离所采用的萃取液是否合理，作如下缓冲纸色谱试验：取层析滤纸3cm×12cm，距下端2cm处划一起始线，向上每隔1.5cm划一平行线，在各条带上依pH由低至高顺次涂布实际所用的各缓冲液及碱液，涂布完后，将湿滤纸夹在两片干滤纸中吸至半干。取样品总蒽醌苷元氯仿提取液点在起始线上，用氯仿上行展开，将结果绘制在下面图中，并确定选择的萃取剂是否合理。（2）分离与精制a.大黄酸的分离和精制将含有总蒽醌的氯仿液450ml于1000ml分液漏斗中，加pH8缓冲液150ml充分振摇，静置至彻底分层，分出碱水层置250ml烧杯中，在搅拌下滴加20％盐酸至pH3，待沉淀析出完全后，过滤，并用少量水洗沉淀物至洗出液呈中性，沉淀干燥后，样品加冰醋酸10ml加热溶解，趁热过滤，滤液放置析晶，过滤，用少量冰醋酸淋洗结晶，得黄色针晶为大黄酸。b.大黄素的分离和精制pH8缓冲液萃取过的氯仿层，用pH9.9缓冲液300ml振摇萃取，静置至彻底分层后，分出碱水层，在搅拌下用20％盐酸酸化至pH3，析出棕黄色沉淀，抽滤，水洗沉淀物至洗出液呈中性，沉淀经干燥后，用15ml丙酮热溶，趁热过滤，滤液静置，析出橙色针晶，过滤后，用少量丙酮淋洗结晶，得大黄素。c.芦荟大黄素的分离与精制pH9.9萃取过的氯仿层再加5％碳酸钠-5％氢氧化钠（9:1）碱水液540ml萃取，碱水层加盐酸酸化，析出的沉淀水洗，干燥，用10ml乙酸乙酯精制，得黄色针晶的芦荟大黄素。d.大黄酚和大黄素甲醚的分离萃取除去芦荟大黄素后余下的氯仿层，再用3％氢氧化钠溶液500m1分二次萃取，至碱水层无色为止，合并碱水层，加盐酸酸化至pH3，析出黄色沉淀，过滤，水洗至中性，干燥，为大黄酚和大黄素甲醚混合物，留作柱色谱分离的样品。余下氯仿液水洗至中性，蒸馏回收氯仿。e.硅胶柱色谱法分离大黄酚、大黄素-6-甲醚装柱：用石油醚－乙酸乙酯（9.8:0.2）浸泡200～300目硅胶约20g，搅拌均匀，尽量赶出气泡。一次性倒入1.8cmX28cm的层析柱中，轻轻敲打使硅胶均匀下沉，至硅胶界面不再下降为止。上样：将离大黄酚和大黄素-6-甲醚的混合物用乙醇加热溶解，伴入少量硅胶，水浴60℃左右烘干，加到已装好的硅胶柱顶端，最后在样品带上盖上一层硅胶或棉花，以保护样品界面不受干扰。洗脱：先用100ml石油醚－乙酸乙酯（9.8:0.2）洗脱，至第一条黄色色带洗下来，再换用100ml石油醚－乙酸乙酯（9.5:0.5）洗脱下第二条色带。4.鉴定(1)蒽醌类成分化学鉴定a.碱液试验分别取各蒽醌结晶数毫克置于小试管中，加2％氢氧化钠溶液lml，观察颜色变化。凡有互成邻位或对位羟基的蒽醌呈蓝紫至蓝色，其它羟基蒽醌呈红色。b.醋酸镁试验分别取蒽醌结晶数毫克，置于小试管中，各加乙醇lml使溶解，滴加0.5％醋酸镁乙醇溶液，观察颜色变化。(2)色谱鉴识a.薄层板：硅胶G-CMC-Na板。b.点样：提取的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的氯仿溶液及各对照品氯仿溶液。c.展开剂：石油醚－乙酸乙酯－甲酸（15:5:1）上层溶液。d.展开方式：上行展开。e.显色：在可见光下观察，记录黄色斑点出现的位置，然后用浓氨水熏或喷5%醋酸镁甲醇溶液，斑点显红色。f.观察记录：记录图谱并计算Rf值。四、思考题1．大黄中5种羟基蒽醌化合物的酸性和极性大小应如何排列?为什么?2．pH梯度法的原理是什么?适用于哪些中药成分的分离?