微藻的筛选与培养

微藻的筛选与培养水污染氮、磷重金属POPs水体富营养化土壤污染及人体伤害人体伤害环境危机温室效应环境危机能源危机非再生能源储量日渐减少，面临枯竭。我国非化石能源比例偏高，不利于经济高速优质发展。环境与能源危机的解决途径新能源开发：太阳能、风能、地热能、生物质能。基于物理、化学以及生物方法的污水处理技术的开发：絮凝、吸附、高级氧化、活性污泥工艺等。CO2等温室气体的处理：吸附、碳固存、人工光合系统、生物固碳。基建投资大、运行管理成本高昂、效率较低、二次污染、潜在技术、比重较低亟需寻求新的高效低成本解决方案19901995200020052010201510000200003000040000500006000070000Biofuelsproduction(thousandtonnes)year什么是微藻？微藻(Ｍicroalgae)是一类在陆地、海洋分布广泛，营养丰富且光合利用度高的微型自养植物。地球上微藻种类繁多，但目前被人类发现并利用的种类不多，特别是海洋微藻，目前开发的更是微乎其微。绿藻红藻硅藻物种已发现数量已发现占估计数比例(%)淡水微藻2.2×104＞90海洋微藻0.7×104＜10为什么是微藻？光合作用效率是指绿色植物通过光合作用制造的有机物中所含有的能量与光合作用所吸收的光能的比值。光合作用效率高植物：1%藻：3.5%微藻通过光合作用固定CO2的效率比陆生植物更高1、反应物浓度更高2、产物浓度更低1L空气中含有约5.9×10-4gCO21L水中含有约1.7gCO21L空气中含有约0.3gO2近3000倍1L水中含有约0.008gO21/403、光照几率更多折射衍射水散射由于水对光具有折射、衍射、散射等效应，使得微藻所有表面都有可能受光照，然而陆生植物只有向光面才有可能受光照。等量1g干物质树叶比表面积:10-3m2微藻比表面积:1.3×103m2相同质量的微藻比表面积是树叶的1.3×106倍，比表面积越大，受光面积越大，越有利于光合作用。4、比表面积更大微藻光合色素含量占其干重的2.5%分布于整个细胞，整个细胞就是一个光合反应器，有利于光合产物的合成与转运。植物光合色素含量占其干重约0.05%,分布于树叶、树干等组织中细胞的特定部位，不有利于光合产物的合成与转运。50倍微藻光合天线植物光合天线几十倍植物的捕光天线是类囊体膜内的叶绿素,而藻类的捕光天线色素主要集中于紧连在类囊体膜外的藻胆蛋白内。天线系统的功能是将所吸收的光能高效地传递到与之相联系的光反应中心。5、更高含量的光合作用单位6、微藻具有独特的CO2浓缩机制CCM(CO2-Concentrationmechanism)：即为CO2浓缩机制。当藻类细胞由高浓度CO2培养转入低浓度CO2，细胞可不断地从外部环境中把无机碳或CO2运输到体内，使体内的CO2浓度高于外界环境，以有利于光合作用碳循环第一个关键酶Rubisco羧化反应，从而能提高光合速率。油脂产率高微藻热解所得生物质燃油热值高生长周期短微藻的生长周期很短(1~10d)，因此收获周期）也大大短于传统农作物，可以实现高产量的连续收获，使其产油效率大大增加。占地面积少不与农作物争地(可用滩涂、盐碱地、荒漠等)、争水(可用生活污水、海水和盐碱水等)。生产成本低藻类含有较高的脂类、可溶性多糖和蛋白质等易热解的化学组分，而木材则以木质素、纤维素等难热解成分为主，因此藻类所需热解条件相对较低，可降低生产成本。同时，藻类易被粉碎和干燥，因而其预处理成本也较低。利用废水中的氮、磷等营养元素，不仅有助于缓解水体富营养化程度降低废水处理成本，且可大幅降低微藻生长所需氮源成本及磷源成本。氧气废气CO2N、P废水阳光生物质环境-微藻-能源耦合体系CO2光合作用转换以徽藻为原料生产生物柴油的主要技术环节CO2优良微藻藻种自然筛选、诱变育种或基因工程手段改造光合反应器或培养池微藻采收或(膜过滤)(离心)湿藻泥油提炼离心分离油和藻渣规模化培养提炼后的藻渣综合利用酒精饲料添加微藻能源生产技术路线图(产油)生物柴油烟气减排自然界中分离、纯化具有潜在价值的微藻藻株的一般步骤和流程藻种的筛选分离和纯化的方法主要有传统的技术(加富培养、利用毛细管挑取单个细胞、固体琼脂平板划线分离、稀释法)和先进的技术(流式细胞仪分选、微孔板和微流控技术)。摘取少许苔藓新鲜茎叶，流水冲洗15min后用蒸馏水洗涤3次，在超净工作台上用软毛刷反复清理苔藓植物表面，然后用Tween20进行清洗，再用蒸馏水冲洗5次，将第5次冲洗完的无菌水收集。在无菌条件下，用研钵将清洗过的苔藓材料研磨制成匀浆液，接入BG-11液体培养基中，放于光照培养箱中培养，培养条件是温度25℃，光照周期为12h：12h。光照强度是25μmol·m-2·s-1。第五次冲洗用的无菌水也接入BG-11液体培养基，在相同的条件下培养。20天后，每五天对培养的第五次清洗的无菌水进行镜检。作为检验苔藓植物表面是否清洗干净的对照。经过3-4周的培养后，用微挑法将藻株挑出后培养在含有BG-11培养基的24孔板中，放于光照培养箱中静置培养，培养条件是温度25℃，光照周期为12h：12h。培养2-3周后再转移到新培养基中扩大培养。形态分类法：即在光学显微镜下，对微藻材料采用临时制片进行观察细胞活体的形态和结构，同时结合藻体固有的生理生化特征来确定其分类地位。鉴定时主要参考书目为《中国淡水藻类—系统、分类及生态》等。藻种的鉴定分子生物学方法：18srRNA、ITS、rbcL、SSU、psaA基因序列分析。生物诱变重离子束紫外线乙基甲磺酸正向和反向遗传学方法改善微藻特性Chlorococcumsp.GD的光学显微镜照片Chlorococcumsp.GD的透射电镜照片。（a）营养细胞。×6，000。（b）细胞壁。×15，000。（c）细胞核。×15，000。（d）线粒体。×15，000。（e）油脂颗粒。×15，000。（f）蛋白核。×15，000。（g）叶绿体，蛋白核。×15，000。（h）高尔基体，内质网。×15，000。（缩写：CW-细胞壁；Chle-叶绿体被膜；Chl-叶绿体片层；S-淀粉颗粒；m-线粒体；Ps-蛋白核基质；Ss-淀粉鞘；Pych-源自叶绿体的穿刺蛋白核的双层膜通道；G-高尔基体；N-细胞核；n-核仁；ER-内质网；LB-油滴。）Chlorococcumsp.GD的扫描电镜照片。（a-b）藻株群体；（c-d）单个藻株。Chlorococcumsp.GD尼罗红染色前后的显微照片。（a）Chlorococcumsp.GD在尼罗红染色前的显微观察照片；（b）Chlorococcumsp.GD在尼罗红染色后的显微照片。（箭头：油脂颗粒）藻株单位体积藻粉干重（mg/L）总脂含量（%dw）总脂产率(mg/L*d)共生藻500mg/L40%10N0.Time(min)NameRelativeamount(%)129.146Hexadecanoicacid23.101230.4047,10-Hexadecadienoicacid4.971331.9097,10,13-Hexadecatrienoicacid5.232432.6974,7,10,13,16,19-Docosahexaenoicacid(all-Z)-5.873533.873Octadecanoicacid8.745634.5229-Octadecenoicacid(Z)-21.617735.3009,12-Octadecadienoicacid(Z,Z)-12.546835.8426,9,12-Octadecatrienoicacid5.199936.4649,12,15-Octadecatrienoicacid(Z,Z,Z)-12.717Chlorococcumsp.GC脂肪酸组成微藻保藏Ⅰ、固体平板低温保种保种时间为2年；Ⅱ、液体低温保种保种时间为1年；Ⅲ、液体常温保种保种时间为3个月。微藻的培养方式1、按培养纯度分2、按培养密闭程度分3、按微藻营养模式分4、按进料方式分按培养纯度分纯培养：即无菌培养。要求最为严格，生产性培养中很难做到。单种培养：指可有细菌存在但只有一种藻类的培养。混合培养：也称多种培养，是指一培养体系中存在两种或两种以上的微藻细胞同时生长。按培养密闭程度分开放式培养：指藻液直接与外界空气相通的一种培养方式，如敞开式大池培养，是生产性培养的主要方式。优点：建池简单，投资少，运行费用低，可利用光温适宜但不宜种植传统农作物的地区或产量低的荒漠、盐碱沙地等。生产操作简单，容易清洗。缺点：CO2供应不足，温度不易控制，水分蒸发严重，光能利用率低，占地广大。易污染，生产不稳定，藻体不易于收获，产量和质量难以保证。封闭式培养：指单胞藻在一相对封闭的体系中培养，主要用于科研研究，也用于生产性培养，也有在工厂化生产中应用。培养体系一般在100L以下。优点：不易染菌，可纯培养，生产效率高，占地面积小，培养密度高，藻体易于收获，水消耗量少，可对运行参数进行控制，受外界自然环境影响小。缺点：建设费用高，运行费用高，表面易形成生物膜，清洗困难，需强化传质、传热及透光，技术先进但不成熟。光生物反应器(Photobioreactor,PBR)搅拌型光生物反应器柱状光生物反应器平板式光生物反应器管道式光生物反应器柱状光生物反应器柱状光生物反应器主要由透明圆柱罐、气体分布装置、温度控制装置、光源组成。4种柱式光生物反应器平板式光生物反应器反应器形状多是垂直立方形，户外规模培养时反应器通常倾斜一定的角度以获得最佳的入射光强度。2种平板式光生物反应器管道式光生物反应器目前，已开发设计出不同类型的光合管道，包括水平式、倾斜式、螺旋形、锥形等，其管道直径小，一般不超过0.1m。2种管道式光生物反应器搅拌型光生物反应器机械搅拌式生物反应器广泛运用在微生物培养上，只要在其内部配套相应的光源，就可成为适合培养微藻的光生物反应器。封闭式光生物反应器的优缺点膜式光生物反应器膜式光生物反应器是利用微藻具有吸附在固体培养基中形成生物膜的趋势研制出的微藻培养光生物反应器。光生物反应器两阶段培养模式按微藻营养模式分营养模式能源碳源光能自养Photoautotrophy光照CO2混合营养Mixotrophy光照有机碳和CO2异养Heterotrophy有机物有机碳光能自养培养在光能自养培养中，微藻利用光照（自然光或人工光照）和无机物（H2O、无机盐和CO2）进行光合作用，合成有机物，维持自身生长。由于微藻都可以进行光合作用，因此光能自养是广泛采用的一种微藻培养方式。异养培养微藻异养培养是指在黑暗条件下微藻利用外加的有机碳源进行培养。混养培养当对特定种类的微藻同时提供CO2和有机碳源时，微藻可进行兼养生长。光自养-异养串联培养异养-光自养串联培养按进料方式分连续培养批次培养流加培养半连续培养批次培养微藻批次培养模式具有操作简单、成本低的优点，是实验室内普遍采用的一种培养方式。近年来，批次培养在“两步法”藻细胞特定产物的规模培养中得到了较广泛的应用。第一步，提供足够的营养盐进批次培养，使藻细胞积累较高的生物量；第二步，缺乏或限制营养元素，从而提高藻体内特定目标产物的含量。流加培养流加培养也称为分批补料培养，是指在培养过程中向培养液中添加一种或多种营养物质的培养方法。流加培养分为恒速流加和变速流加两种方式。恒速流加是以均匀的流加速度逐渐向培养液内加入营养盐；而变速流加则是根据培养生物的生长特点进行非线性流加的一种培养方式。限制流加，即通过营养盐低量流加方式限制培养液中营养元素的浓度，也是经常采用的一种流加培养方式。特定营养盐的限制流加可促进藻细胞内特定物质的积累。半连续培养半连续培养是在一次性培养的基础上，当藻细胞达到一定浓度后，收获一定量的藻液，补充等量培养液继续培养。由于微藻更新率不仅影响微藻的细胞密度，而且影响微藻的生长速率。因此，可在合适的更新率条件下结合营养盐的限制添加，在不降低生物量的同时促进细胞内油脂的积累，为微藻生物质的大规模生产以及微藻生物能源的发展提供重要