《基因工程》课程综合实验---转基因斑马鱼的构建

《基因工程》课程综合实验---转基因斑马鱼的构建实施方案《基因工程》课程综合实验教学在专业培养目标中的定位与目标《基因工程》是生命科学学院等各专业的专业主干课，在这些专业的本科生教学计划中占有极为重要的地位。《基因工程》也是我们学校基地班和生技专业的专业必修课，已经有10余年的开课历史。全国其他高等综合院校都十分重视《基因工程》课程建设，绝大多数院校都将《基因工程》作为学校精品课程进行建设。湖南师范大学大学在《基因工程》教学和研究方面具有坚实的基础，2008年《基因工程》建设成为了湖南省精品课程，从而为我校《基因工程》的教学改革提供了契机。基因工程是以遗传学为理论基础的一门实践性很强的学科，是生物学科中一门体系还欠完整却发展十分迅速的学科，对探索生命的本质、推动整个生物学科的发展起着巨大的作用；同时又是一门紧密联系生产实际的实验科学，对新品种选育和良种繁育、遗传疾病防治等都具有重要的应用价值。通过《基因工程》的学习，使学生掌握基因工程的基本原理、基本方法和最新发展动态；通过《基因工程》课程综合实验教学，使学生熟悉基因工程的基本操作方法，注重对学生的实验操作技能的培养。基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建教学大纲课程名称：基因工程（实践课程部分）课程编号：面向专业：生物技术、生物科学、基地班课程总学时：理论51学时，实验34学时_实验学时：34_课程学分：理论3学分，实践2学分一、实验目的本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生基因工程基本实验操作、实验设计、实验结果分析和创新实验能力，通过基因工程综合实验的开设，注重学生综合素质和实践能力的培养。二、实验内容、学时分配与组织序号实验项目名称内容提要实验性质实验类型学时分配每组人数备注1目的基因的获取与重组载体的构建1．以pEGFP-C2为载体，组织特异启动子为供体DNA，进行连接。2．感受态细胞的制备；4．重组子转化的鉴定专业基础94必做2质粒的提取与重组子的鉴定1．质粒的小量提取2．限制性核酸内切酶进行酶切鉴定3．PCR鉴定专业基础84必做3重组载体的线性化和受体系统的获得1．表达质粒的大量制备2．表达质粒的线性化及回收纯化3．鱼受精卵的获得及培养专业基础提高型54必做4显微注射及转基因表型分析11.显微注射制备转基因鱼2.转基因鱼的表型鉴定3、转基因鱼纯合子的获得综合提高型（综合型）124必做三、教学管理模式与注意事项1．学生在实验前必须认真复习课程有关内容，预习实验指导书。2．指导教师适当讲解相关理论及注意事项，提示具体的实验方法和操作，演示重要仪器的使用。3．实验小组人数为4人，由学生独立操作。每个实验的时间根据实验流程本身决定，长短不一，但需要集中的时间。4．要求学生掌握基本的操作方法，如实逐项记录数据，独立完成实验报告，并当天上交。四、成绩评定与占课程总成绩的比例1．指导教师对实验报告应认真批改，记录每一次的实验成绩。2．根据平时实验操作成绩，给出实验操作考试成绩，以占课程总成绩30%的比例纳入课程的总成绩。五、设备与器材配置（每组）1．试管、试管架、可调式微量加样器等；2．电泳仪、电泳槽、染色缸；42℃恒温水浴箱、冰浴；3．恒温振荡箱，超静工作台。4．手动显微注射器、体式显微镜，硼硅酸玻璃毛细管。5．倒置显微镜、摄像系统（CCD），发圈。6．自动水循环系统一套，孵化水槽。六、实验指导与参考资料1．基因工程实验指导，转基因斑马鱼的构建，湖南师范大学生命科学院遗传与发育生物学系自编，，2009年2.盛小禹.基因工程实验技术教程复旦大学出版社。3．彭秀玲.袁汉英.谢毅.王洪海.基因工程实验技术湖南科学技术出版社。《基因工程》课程综合实验教学可行性分析一、转基因动物简介转基因动物（transgenicanimal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。转基因技术涉及外源基因的组建、载体、受体、基因导入技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等方面的内容。二、斑马鱼具有实验动物诸多优点斑马鱼实验室繁殖与操控技术斑马鱼原产于印度、孟加拉等国,属鲤科。是一种亚热带淡水观赏经济鱼类,成鱼体长大约5cm，呈黄褐色,体表从头到尾覆盖着水平方向的蓝紫色条纹,故又称蓝条鱼。雄性皮肤偏柠檬色,雌性皮肤偏银灰色,鳍条宽大,发达。斑马鱼具有繁殖能力强，一年四季都可产卵，产卵可达300～1000粒，成活率高；卵大、卵径1～1.5mm，体外受精和发育，胚胎透明；性成熟周期短，繁殖周期短，一般7天左右；个体小易养殖，饲养成本低等诸多优点。1.斑马鱼受精卵可在实验室获取。受精前将亲鱼公、母分开饲喂2～3天(相互之间能够看到,可在饲养箱中加一玻璃隔板,将公、母分开)，繁殖时将公、母按1～2∶1比例放入产卵池中进行产卵受精。2.斑马鱼的卵的孵育快而方便人工孵化受精结束后获得的受精卵要及时捞出，剔除异物。然后将受精卵移入培养箱中进行孵化，温度为25～28℃，温差不能够超过0.5℃。这期间可在解剖镜下观察胚胎的发育状况。大约经过2天孵化，小鱼就可出膜。3.斑马鱼孵化后的喂养容易操纵孵化时应注意：①虹吸出产卵池底的受精卵时要用直径1cm左右的皮软管,如果用硬质的吸管,有可对受精卵造成损伤。②孵化用水、清洗用水，水质要好，水温相差不宜过大，要保持相对恒定，对受精卵来说，剧烈的温度变化会引起胚胎死亡。③孵化期间每天要及时清除败育卵，勤换水。刚孵出的仔鱼呈淡黄色，在解剖镜下可见到跳动的心脏，流动的血液，腹部有一很大的、未吸收的卵黄囊。头2～3天仔鱼静卧于水底,，此时不需要饲喂。注意及时将卵膜和白色的死卵捞出，每天更换新水，将鱼苗置于温室内，温度为25℃(可放在空调房间内)。3～4日龄时仔鱼可自由游泳(平游)并开始觅食，此时可用绢网取少许蛋黄在水中轻轻地搅动，至水微呈淡黄色。适当加喂钙素母片、复方ＶＢ液、土霉素等，以提高鱼苗的成活率。喂要少量多餐，日喂3～4次。7～10日龄时加喂草履虫，啤酒酵母等，3周龄投喂卤虫的无节幼体,并逐渐添喂配合饲料。在饲喂过程中要注意水质的变化，勤换水，少喂勤添，以确保鱼苗健康生长。三、斑马鱼基因移植的方法可靠基因移植的方法包括细胞质的显微注射，发生泡的显微注射，胚胎或精子的电转移，逆转录病毒感染及颗粒枪攻击等。其中显微注射法：在显微镜下，可借助显微操作仪，将毛细玻璃管直接插入受精卵的雄原核中(较大的原核)，注入特定的外源基因，即为基因显微注射法。此法的优点是，在一定设备和经验条件下，实验过程大为简化；任何DNA顺序都可直接导入原核内，导入的外源DNA在卵裂前与受体基因组整合，其缺点在于导入的外源DNA通常以多拷贝串联的形式随机地整合于受体基因组中，妨碍其表达的正常调节。用拉制的毛细血管针往刚受精的乱的细胞质注射DNA是制作转基因鱼的最可靠方法，其生殖系遗传和转基因表达的效率皆令人满意。因此，显微注射法仍然是将DNA导入与基因组的最常用方法。往细胞质进行DNA显微注射产生转基因鱼的一般的步骤是：①准备育种种群；②收集受精卵；③向1-细胞胚胎细胞质注射DNA；④鉴定携带转基因的鱼；⑤将首代动物与野生型鱼交配确证通过生殖系遗传。为提高胚胎的存活率和获得转基因首代动物的总效率，需要用保证DNA最佳纯度的标准方法制备DNA构件。转基因整合的效率取决于注射的DNA浓度，而卵的存活能力与DNA浓度则呈相反的关系。控制注射到细胞的DNA量是通过DNA浓度而不是注射DNA溶液的体积来调节。为代偿注射到大体积的细胞质导致DNA的稀释，为使注射的DNA进入细胞核达到适当的概率，而同时也使注射后的胚胎维持令人满意存活率（50％），注射时所用DNA的浓度应配成50～200ng/ml（约大于104～106转基因靠拷贝）。四、转基因鱼实验方法可行1．转基因鱼制备（1）材料斑马鱼1细胞期受精卵（2）仪器、用具手动显微注射器、体式显微镜、倒置显微镜、眼科镊、摄像系统（CCD）、注射针、发圈、小酒精灯、数码相机、硼硅酸玻璃毛细管（3）试剂准备好的重组目的片段的质粒。（表达载体构建是本综合实验的重要组成部分，由于实验中心分子生物学实验室已具备表达载体构建条件及相应的技术平台，在本讨论稿中不再提出有关分子操作的实验细则）（4）方法①注射外源DNA的处理，注射时所用的DNA浓度应配成0.15μg/μl。②DNA(5μl)填装入注射针，不要引入气泡，以免干扰注射。③将成批分选和洗净的卵移到有琼脂糖的表面皿中。④一边轻轻地用眼科镊将卵固定，将卵定位在视野中心，使动物极方向向上。⑤注射前小心将显微注射针定位，将针垂直定位到卵表面是穿透坚硬的卵壳注射成功的关键。⑥然后推动注射针，使其刺入受精卵的动物极一细胞中，将DNA注入(约2nl)。⑦注射完毕，慢慢抽出注射针,将受精卵放入装有水的培养皿中，使其恢复。一般50～80％的受精卵在显微注射后仍保持健康。2．转基因鱼的孵化。斑马鱼在干净的水中孵化注射后的卵，及时清除死去的卵，并记录正常发育和死亡的卵数。