质谱、LC-MS技术的基础

再帕尔•阿不力孜中国医学科学院北京协和医学院2008年4月15日质谱、LC-MS技术的基础及其在天然产物和药物分析中的应用药物研究所质谱技术的主要特点及功能★（高）灵敏度是质谱的“生命”★离子化（技术）是质谱的“心脏”如，2002年度化学诺贝尔奖授予给了J.B.Fenn和田中耕一等三人；其中他们二人“发明了可分析生物大分子的质谱分析法”，即电喷雾电离质谱(ESI-MS)和基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)。★基本功能：（1）（最基本）提供分子量信息；（2）根据MS/MS或MSn等，（定性）结构分析；（3）根据LC-MS/MS方法，进行定量分析；（4）在组学中的应用……近二十年来，有机质谱有了飞跃发展，主要表现为以下三方面：■离子化技术（包括接口技术）的创新和不断改进■串联及联用技术（MS/MS，LC-MS/MS等）的发展，且多样化、小型化和智能化。■敞开（常压）式质谱新技术（AmbientMassSpectrometry）的出现（新飞跃）MS/MS的类型目前已经发展成为具有多种类型的MS/MS仪。如：1.两台质谱仪串联组成（空间序列，MS/MS）磁质谱—磁质谱、磁质谱—Q、磁质谱—Tof、磁质谱—Trap、QqQ、Q—Tof、Tof—Tof、QTRAP、LTQOrbitrap（组合型）、HDMS.……2.储存离子的分析器组成（时间序列，MSn）FT-ICRMS、ITMS(3D离子阱)、LTQ……2000年提出冷喷雾质谱（ColdsprayIonization）技术。2004年以来开放环境下实现离子化的新型技术—敞开（常压）式质谱方法（AmbientMassSpectrometry）的出现尤为关注。代表性的有DESI（解吸电喷雾）和DART（直接实时检测）等电离技术。其主要特点是不需要在真空环境下实施电离、不需要样品的前处理，且适用于气体、液体和固体样品等。在爆炸物、毒品，药代动力学、高通量药物筛选、药物及药品和癌症诊断的快速检测等方面得到了成功的应用。2006年，LTQ-Orbitrap型质谱仪的研发成功，改变了离子阱和高分辨的发展模式。2007年最新推出的HDMS仪增加了质谱技术的分离能力。最新技术敞开式（电离）质谱(AmbientMassSpectrometry)DESI-MSR.G.Cooks,etal,Science,2004and2006DESI（DesorptionElectrosprayIonization）人肝组织中非癌变与癌变部位的直接比较分析DESI-MSDART(R.B.Cody,etal,Anal.Chem.,2005,77,2297)应用前景天然产物分子鉴别以及中草药物质基础组分群的高效、快速的质谱分析方法研究对于药用植物（含中草药）中具有生物活性的天然产物有效部位进行快速分析在新药研制过程中越来越重要。而且我国加入WTO以后，以仿制为主的西药研制遇到严重挑战。我国从“十五”计划开始，尤其是在国家中长期科技发展规划纲要中进一步提高了对创新药物和中医药现代化研究的重视，将发展现代中药的研发技术列入优先主题内容，并明确提出要推进中药现代化和国际化。与此同时，将高通量的分离及纯化系统、高通量活性筛选技术与串联质谱技术、LC-MS/MS等分析技术结合起来的研究体系是近几年国际上药用植物研究的前沿领域，也是创新药物研究的重要环节。系统地开展中草药物质基础组分群的分析研究，高效、快速地发现新颖结构的活性天然产物，是先导物发现和创新药物研制的重要及有效途径。前言质谱分析的主要电离技术及其应用范围：EI-MS:高挥发性、一般分子量≤1,000Da的化合物CI-MS:高挥发性、一般分子量≤1,000Da的化合物FAB-MS:热不稳定、难挥发性、中等极性，分子量≤3,000Da的化合物……ESI-MS:热不稳定、中至高极性，可检测到数十万Da分子量的化合物，混合物，此外（包括APCI-MS，相对弱极性分子）真正实现了LC-MS技术。MALDI-(Tof)MS:主要用于蛋白质等生物大分子的测定（可检测到近百万Da分子量）。研究思路验证分析单体化合物的(±)离子化探讨；(±)ESI-MS及ESI-MSn谱；另选用(±)FAB-MS,或EI/CI-MS等混合物的(±)ESI-MS及ESI-MSn谱；(±)FAB-MS谱（Na+离子的作用）混合物的GC-MS,或LC-UV,LC-MS及LC-MSn谱混合物的HRMS测定组分的NMR或LC-NMR谱分析1.运用多种不同电离技术及其正负离子检测方式相结合的MS/MS等质谱手段，系统地开展了不同类型天然产物的离子化特征、质谱行为及其与结构特征之间的相关性等研究。2.发现了一系列新颖独特的特征裂解反应和鉴别结构细微差异或特点的质谱变化规律。3.在分子结构鉴别、确定取代基种类及其位置、糖链的连接位置及其顺序等关键和具有难度的鉴别方面取得了进展。4.在上述基础上，结合LC-MS/MS等联用技术，建立了运用不同质谱手段及谱学信息相结合的‘互补性’分析思路，开展药用植物有效部位（含中草药物质基础）中组分群分析的高效、快速、微量的质谱分析方法。从而使复杂混合物体系中相关成分的快速分析实现了快捷化和简便化。主要研究成果本项研究成果不仅在质谱学、结构分析和天然药物化学上具有重要学术意义和应用价值，也为中草药物质基础中结构新颖活性组分（群）的高效、快速发现体系的建立提供了新的分析思路和有效的技术平台。这些系统性研究得到了国内外质谱及分析化学界的公认。其相关成果先后两次被引用到英国皇家化学学会出版的著名刊物‘NaturalProductReports’(2004,21:625-649;2005,22(5):603-626)的Review里，同时作者评价这种由结构差异导致的裂解方式的特征多样性可作为新化合物结构确证的有力手段；获得的信息为在线鉴定植物粗提物中微量组分提供了可靠的分析依据。三分丹提取物的成分分析1.菲骈吲哚里西啶类生物碱的质谱裂解规律研究2.三分丹植物中活性提取部位的微量成分质谱分析方法研究(1)YunXiang,A.Zeper,etal.RapidCommun.Massspectrum.2002，16:1668-1674(2)CuiLJ,A.Zeper,etal.RapidCommun.MassSpectrom.2004,18:184-190化合物B4,B5B1,B2,B3化合物B6,B7B8NOH14NOHO14NN14菲骈吲哚里西啶类生物碱的结构类型结构类型结构类型phe-1中[M+H]+离子的FAB-MS/MS谱NOHCH3OOCH3CH3Ophe-4中[M+H]+离子的FAB-MS/MS谱NOHHOOCH3CH3O菲骈吲哚里西啶类生物碱的特征裂解反应（1）[M+H-H2O]+NMeOOOCH3H-CH4NOOMeONMeOHOOMe-CH3++H++H++H[M+H-H2O-CH3]+B1中丢失CH4的裂解反应机理结合MS3、中性丢失扫描、母离子扫描谱等分析NCH3OOOHCH4NCH3OOOCHHHNCH3OOOCH3CHHHCH3-CH4（主要反应）-·CH3-·HESI-MS/MSspectrumofB1丢失CH4的特征裂解反应(AutoSpecUltima-Tof)NH3COOCH3H3COcl-CH4(1)MS2spectrumofM+atm/z360forB1;(2)MS3spectrumof[M-CH3]+▪atm/z345(1)(2)ESI-MSn谱分析(LCQ)MS2MS3+MS2(360.00)CE(43):0.151to0.754minfromSample5(B1-MS2...Max.2.0e6cps.250260270280290300310320330340350360370380m/z,amu0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%Rel.Int.(%)344.1360.2316.1301.0287.1345.1+MS3(360.20),(345.00):0.066to0.715minfromSample7(B1-MS...Max.1.3e7cps.290295300305310315320325330335340345350355m/z,amu0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%Rel.Int.(%)344.3345.2317.3302.3316.3MS2spectrumofM+atm/z360forB1MS3spectrumof[M-CH3]+▪atm/z345forB1ESI-MSn谱分析(QTRAP)MS2MS3碰撞信息增多+NL(16.00):0.084to0.637minfromSample8(B1-NL16)ofB1.wi...Max.1.2e6cps.300310320330340350360370380390400m/z,amu0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%Rel.Int.(%)360.3361.3NLS16forB1中性丢失扫描谱分析(QTRAP)M++Prec(344.00):0.151to0.268minfromSample9(B1-PREC344)o...Max.2.1e6cps.330335340345350355360365370375380m/z,amu0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%Rel.Int.(%)360.4344.3+Prec(345.00):0.101to0.352minfromSample10(B1-PREC345)...Max.4.4e5cps.330335340345350355360365370375380m/z,amu0%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%Rel.Int.(%)361.3360.4345.3346.3PRESofm/z344forB1PRESofm/z345forB1母离子扫描谱分析(QTRAP)M+M+NCH3OCH3OOCH3OH+H+HN+m/z70NCH3OCH3OOCH3N-CH3OCH3OOCH3+H++H+[M+H-69]+RDARDARDANCH3OCH3OOCH3+H+×菲骈吲哚里西啶类生物碱的特征裂解反应（2）NMeOHOOMeOHO++H_NOHMeOHOOMe+rHNOH+RDAm/z86RDANCH3OCH3OOCH3OH+H+NOHCH3OCH3OOCH3-NOHOCH3OCH3OOCH3++[M+H-87]+[M+H-86]+菲骈吲哚里西啶类生物碱的特征裂解反应（3）350281348697350699B5360345344329,301344329301301360755B8382364346331295349,336,321,295380761382763B7396378360345,344309363,309,350,335396791B6364295364727B4366348346331297364729366731B3366348346331,330397364729366731B2380362360345,344311380759B1MS4(m/z)MS3(m/z)MS2(m/z)precursorion(m/z)Negativeion(m/z)Positiveion(m/z)MainpositiveionESI-MSndataESI-MSdataCompound菲骈吲哚里西啶类生物碱ESI-MSn质谱裂解行为D环饱和的菲骈吲哚里西啶类生物碱紫外吸收特征:260nm、285nm、315nm(sh)有紫外吸收。季胺盐类菲骈吲哚里西啶类生物碱紫外吸收特征：268nm、292nm有紫外吸收。N氧化的菲骈吲哚里西啶类生物碱紫外吸收特征：260nm、285nm，其中285nm处紫外吸收有所增强。NCH3OCH3OOCH3OHNCH3OCH3OOCH3+NCH3OHOOCH3